《Advanced Science》：PTG-Dependent Glycogen Metabolic Dysfunction Drives Impaired Adipose Browning: A Novel Mechanism Linking PM2.5 to Metabolic Disorders
1 引言
細顆粒物（PM2.5）作為關鍵的環境污染物，其與代謝綜合征易感性增加之間的關聯已被廣泛證實。作為人體最大的內分泌器官，脂肪組織在代謝調節中發揮基礎作用。其中，腹股溝白色脂肪組織（iWAT）通過寒冷暴露或β-腎上腺素能受體刺激獲得棕色脂肪組織（BAT）樣產熱能力，這一棕色化過程通過解偶聯蛋白1（UCP1）依賴性產熱增強能量消耗。既往研究雖證實PM2.5暴露顯著損害白色脂肪組織（尤其是iWAT）棕色化，但其精確分子機制尚不清楚。
糖原作為哺乳動物主要的葡萄糖儲存聚合物，是重要的能量儲備。毒理學證據表明PM2.5暴露會減少肝糖原儲存并抑制肝糖原合成。盡管脂肪組織通常比肝臟或肌肉維持較低的基礎糖原含量，但在禁食-再喂養周期中表現出動態的糖原波動，提示其參與急性代謝調節。蛋白靶向糖原（PTG），由Ppp1r3c編碼并在脂肪細胞中高表達，是蛋白磷酸酶-1（PP1）的關鍵調節亞基，協調糖原合成。近期研究發現脂肪細胞特異性PTG缺失會降低米色脂肪細胞糖原含量，損害UCP1表達，并減弱肥胖小鼠中寒冷或β-腎上腺素能受體刺激的體重減輕。然而，PTG在PM2.5介導的iWAT棕色化損傷中的潛在作用尚未被研究。
β3-腎上腺素能受體（ADRB3）是棕色和米色脂肪細胞內適應性產熱的關鍵介質。作者前期工作發現ADRB3甲基化及其后續下調是PM2.5損害iWAT棕色化的關鍵機制。有研究表明β-腎上腺素能信號傳導增強了PTG轉基因小鼠模型中的糖原周轉，提示了β-腎上腺素能信號與糖原代謝之間的串擾。然而，ADRB3是否通過PTG調節的糖原代謝介導PM2.5抑制的iWAT棕色化仍屬未知。
本研究采用全身吸入暴露系統研究PM2.5對iWAT棕色化和糖原代謝的影響。通過整合體內外方法，闡明了PTG在介導PM2.5抑制iWAT棕色化中的核心作用。數據庫預測和后續驗證支持了一個涉及ADRB3-PTG-VEGFB信號通路的新型調節軸。
2 結果
2.1 PM2.5特征
研究中使用的全身吸入暴露系統是一種經過驗證的PM2.5暴露建模方法。該系統直接采樣環境室外空氣，每日PM2.5暴露濃度動態反映室外空氣質量波動，從而準確模擬真實世界的人類暴露模式和場景。在過濾空氣（FA）艙和PM2.5艙中，小鼠暴露的平均每日PM2.5濃度分別為2.15 ± 0.47 μg/m3和40.18 ± 4.70 μg/m3。PM2.5成分分析顯示，在水溶性無機離子、金屬元素和非金屬元素中，硫酸鹽（SO42?）、鋁（Al）和砷（As）分別是最豐富的物種。
2.2 PM2.5暴露抑制全身代謝和iWAT棕色化
首先研究了PM2.5暴露對全身代謝的影響。雖然PM2.5暴露未顯著影響小鼠體重，但顯著增加了體重增長。PM2.5暴露小鼠的脂肪量及其與體重的比率也顯著增加。腹腔葡萄糖耐量試驗（IPGTT）顯示，PM2.5暴露小鼠在葡萄糖給藥后60分鐘血糖水平和曲線下面積（AUC）顯著更高。PM2.5暴露后，產熱被顯著抑制，證實PM2.5暴露引起小鼠代謝紊亂。
隨后深入探究了PM2.5暴露對iWAT棕色化的影響。PM2.5暴露顯著增加了iWAT的質量和器官系數。蘇木精-伊紅（H&E）染色顯示PM2.5暴露改變了iWAT形態，表現為脂肪細胞尺寸增大。與脂肪細胞產熱和米色脂肪細胞相關的標志分子（如Ucp1、CD137、Cidea、Cox8b和Pgc1α）的mRNA表達在PM2.5暴露小鼠的iWAT中高度下調。免疫組織化學和蛋白質印跡分析均顯示PM2.5誘導的iWAT中UCP1表達顯著降低。在細胞水平上，不同濃度的PM2.5也顯著抑制了3T3-L1脂肪細胞中產熱基因的mRNA表達和UCP1蛋白表達。這些發現表明PM2.5暴露抑制了iWAT棕色化。
2.3 PM2.5暴露抑制iWAT中的糖原代謝
為闡明PM2.5暴露對iWAT糖原代謝的影響，評估了iWAT中的糖原含量，觀察到PM2.5暴露后糖原水平顯著降低。高碘酸-雪夫（PAS）染色顯示PM2.5暴露后糖原積累減少。
由于PTG是協調糖原代謝的關鍵支架蛋白，研究了其在PM2.5暴露后小鼠iWAT和3T3-L1脂肪細胞中的表達。PM2.5暴露導致小鼠iWAT中Ppp1r3c的mRNA表達水平和PTG蛋白表達水平顯著降低。分析顯示小鼠iWAT中Ppp1r3c的mRNA表達與Ucp1的mRNA表達呈顯著正相關。與此一致，PM2.5暴露也以濃度依賴性方式顯著降低了3T3-L1脂肪細胞中Ppp1r3c的mRNA水平和PTG的蛋白水平。此外，在3T3-L1脂肪細胞中，Ppp1r3c和Ucp1的mRNA表達水平也呈正相關。
鑒于PTG在糖原代謝中的核心作用，進一步檢測了小鼠iWAT中糖原合成和分解限速酶的表達水平。PM2.5暴露顯著降低了肝糖原合成酶（hGS，由Gys2編碼）的mRNA和蛋白水平，肌糖原合成酶（mGS，由Gys1編碼）的mRNA和蛋白水平也呈現下降趨勢。相比之下，糖原分解酶的表達水平保持不變，表明PM2.5暴露后iWAT中糖原合成酶下調。
這些結果表明PTG表達降低可能導致PM2.5抑制的糖原合成，最終導致iWAT糖原含量減少。
2.4 PTG過表達改善PM2.5誘導的iWAT糖原代謝失調
通過原位注射AAV9建立了特異性PTG過表達小鼠模型（AAV9-PTG），隨后進行PM2.5暴露。驗證顯示AAV9-PTG小鼠iWAT中Ppp1r3c的mRNA水平增加了約106倍，PTG蛋白水平顯著上調，證實模型構建成功。
隨后研究了PTG過表達對PM2.5暴露小鼠iWAT糖原代謝的調節作用。發現PTG過表達顯著提高了小鼠iWAT中的糖原含量，并有效緩解了PM2.5暴露誘導的糖原含量減少。PAS染色進一步證實了這一現象。PTG過表達顯著上調了糖原合成酶亞型（Gys1, Gys2）的mRNA表達水平，并有效抵消了PM2.5誘導的這些基因在小鼠iWAT中的減少。此外，它還顯著提高了小鼠iWAT中mGS和hGS的蛋白表達水平，并有效逆轉了PM2.5暴露引起的hGS蛋白表達下調。
在3T3-L1脂肪細胞中，通過腺病毒轉染建立了PTG過表達（Ad-PTG）細胞模型，然后暴露于PM2.5。驗證顯示在Ad-PTG細胞中，Ppp1r3c的mRNA水平增加了約10倍，伴隨PTG蛋白水平顯著升高，證實PTG過表達細胞模型成功建立。PTG過表達顯著增加了hGS的mRNA和蛋白水平，并逆轉了PM2.5誘導的3T3-L1脂肪細胞中hGS的下調。
總之，這些發現表明PTG過表達通過調節糖原合成酶（特別是hGS）的表達，顯著增強了被PM2.5暴露抑制的iWAT中的糖原含量。
2.5 PTG過表達減輕PM2.5誘導的全身代謝功能障礙和iWAT棕色化損傷
研究了PTG過表達對PM2.5暴露小鼠全身代謝的影響。雖然各組體重變化軌跡無差異，但PTG過表達顯著抑制了小鼠體重增長，并有效減輕了PM2.5誘導的體重增長增加。PM2.5暴露誘導的脂肪量及其與體重比率的增加在PTG過表達小鼠中得到顯著減輕。此外，PTG過表達不僅顯著增強了葡萄糖耐量，而且逆轉了PM2.5暴露引起的小鼠葡萄糖耐量受損。能量代謝進一步分析顯示，PTG過表達對白天總產熱無顯著影響，但顯著增加了夜間活動峰值時的總產熱，并緩解了PM2.5暴露引起的產熱減少。這些發現表明PTG過表達可顯著改善PM2.5暴露誘導的小鼠全身代謝紊亂，包括脂肪代謝、葡萄糖代謝和能量代謝。
進一步評估了PTG過表達對PM2.5暴露小鼠iWAT產熱功能的影響。PM2.5暴露誘導的iWAT質量和器官系數的增加被PTG過表達有效減輕。H&E染色進一步證實PTG過表達顯著減小了iWAT中脂肪細胞的尺寸，并有效逆轉了PM2.5暴露誘導的細胞肥大。紅外熱成像結果顯示，與各自對照組相比，PTG過表達顯著提高了FA和PM2.5暴露小鼠iWAT的局部溫度。qRT-PCR結果顯示PTG過表達顯著上調了Ucp1、CD137、Cox8b和Pgc1α的mRNA表達水平。AAV9-PTG-PM2.5組中Ucp1、Dio2和Pgc1α的mRNA表達水平顯著高于AAV9-GFP-PM2.5組。免疫組織化學和蛋白質印跡結果進一步證實PTG過表達顯著上調了UCP1蛋白表達水平，并有效逆轉了PM2.5暴露誘導的UCP1表達下降。這些結果表明PTG過表達顯著改善了PM2.5損傷的小鼠iWAT產熱功能。
隨后在細胞水平進行了驗證。PTG過表達顯著增加了3T3-L1脂肪細胞中Ucp1、CD137、Cox8b和Pgc1α的mRNA表達水平。此外，它有效抵消了PM2.5抑制的這些基因的表達，盡管Dio2和Cidea的水平保持不變。蛋白質印跡分析進一步證實PTG過表達顯著增加了UCP1蛋白表達，并有效逆轉了PM2.5觸發的3T3-L1脂肪細胞中UCP1蛋白水平的降低。
為進一步驗證糖原在iWAT棕色化過程中的作用，用不同濃度的糖原處理3T3-L1脂肪細胞。隨著糖原濃度增加，3T3-L1脂肪細胞中UCP1蛋白的表達水平顯著增加。這些發現表明增加糖原含量可顯著促進3T3-L1脂肪細胞的棕色化過程，并進一步證實了PTG通過調節糖原代謝在iWAT棕色化中發揮重要作用的分子機制。
2.6 PTG過表達減輕PM2.5誘導的iWAT線粒體功能障礙
線粒體作為細胞能量代謝的核心場所，在iWAT棕色化過程中起著關鍵作用。進一步研究了PTG過表達對PM2.5暴露小鼠iWAT線粒體功能的影響。透射電子顯微鏡顯示PM2.5暴露導致iWAT線粒體嵴結構紊亂，而PTG過表達顯著改善了線粒體嵴結構的完整性。它還增加了iWAT中的線粒體數量，并有效緩解了PM2.5暴露誘導的線粒體數量減少。
隨后分析了線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）組分的表達水平，包括復合物I-IV和ATP合酶（復合物V）。PTG過表達顯著上調了OXPHOS相關基因的mRNA表達水平，包括NADH脫氫酶鐵硫蛋白9（Ndufb9）、琥珀酸脫氫酶復合體亞基B（Sdhb）、泛醇-細胞色素c還原酶R亞基B（Uqcrb）、細胞色素c氧化酶亞基5A（Cox5a）和ATP合酶亞基5A1（Atp5a1）。值得注意的是，PTG過表達顯著逆轉了PM2.5誘導的Ndufb9、Uqcrb、Cox5a和Atp5a1mRNA表達下調。蛋白質印跡進一步證實，與AAV9-GFP-FA組相比，AAV9-PTG-FA組中NDUFB9、UQCRFS1和COX5A的蛋白表達水平顯著更高。同時，NDUFB9、SDHA、UQCFS1和COX5A的蛋白表達水平被PM2.5暴露下調，這些在PTG過表達后顯著增加，而ATPB的表達水平未顯著改變。
然后在細胞水平驗證了結果。O2K檢查顯示，在0 μg/mL或100 μg/mL PM2.5處理條件下，PTG過表達顯著增加了3T3-L1脂肪細胞的基礎呼吸、最大呼吸和ATP產量。值得注意的是，PTG過表達顯著緩解了PM2.5暴露引起的最大呼吸減少。然而，各組間的質子漏水平無顯著差異。此外，PTG過表達顯著上調了NDUFB9、UQCRFS1、COX5A和ATPB的蛋白水平，并有效改善了PM2.5誘導的NDUFB9、SDHA、COX5A和ATPB蛋白水平下降。
總之，PTG過表達通過增強線粒體形態、數量和功能，在維持PM2.5暴露后iWAT棕色化中發揮了關鍵作用。
2.7 VEGFB介導PTG過表達對PM2.5損傷iWAT棕色化的保護作用
為闡明糖原代謝在PM2.5暴露抑制iWAT棕色化中的作用機制，使用GeneMANIA數據庫對核心分子Ppp1r3c和Ucp1進行了基因相互作用網絡分析。從得到的網絡中，篩選出候選分子短名單，其中血管內皮生長因子（VEGF）被確定為潛在的分子靶點。驗證發現VEGFB（VEGF家族成員）是糖原代謝的關鍵調節因子，而非其他分子。
進一步證實PTG過表達顯著降低了iWAT和3T3-L1脂肪細胞中的VEGFB蛋白水平，而PTG敲低則增加了3T3-L1脂肪細胞中的VEGFB表達。值得注意的是，PM2.5暴露上調了iWAT和3T3-L1脂肪細胞中的VEGFB蛋白水平，這一效應被PTG過表達抵消。此外，升高的糖原濃度抑制了3T3-L1脂肪細胞中的VEGFB蛋白表達，而VEGFB敲低并未改變PTG表達，清楚地表明PTG通過糖原對VEGFB表達的調節。
為闡明VEGFB在PM2.5暴露抑制iWAT棕色化反應中的作用，通過siRNA轉染建立了VEGFB敲低細胞模型。VEGFB敲低顯著上調了Ucp1、CD137、Dio2、Cox8b和Pgc1α的mRNA水平。此外，它有效抵消了PM2.5誘導的Ucp1、CD137和Pgc1αmRNA水平下調。蛋白質印跡分析進一步顯示VEGFB敲低本身導致UCP1蛋白水平顯著增加，并顯著逆轉了PM2.5暴露對UCP1表達的抑制。
此外，VEGFB敲低顯著提高了OXPHOS分子（包括Ndufb9、Sdhb、Uqcrb和Cox5a）的mRNA水平，并有效緩解了PM2.5誘導的Ndufb9、Uqcrb和Cox5a的減少。在蛋白水平上，VEGFB敲低僅增加了NDUFB9和COX5A的蛋白表達，而它顯著改善了PM2.5誘導的NDUFB9、SDHA、UQCRFS1和COX5A蛋白表達下調。然而，各組間Atp5a1mRNA或ATPB蛋白的表達水平保持不變。總之，VEGFB敲低可通過增強產熱功能和改善線粒體氧化磷酸化，有效緩解PM2.5暴露對3T3-L1脂肪細胞棕色化的抑制作用。
2.8 ADRB3作為PM2.5抑制iWAT棕色化中PTG的上游調節因子
作者前期發現表明ADRB3信號傳導是PM2.5暴露損害iWAT棕色化的關鍵分子機制。接下來分析了ADRB3是否通過調節PTG和VEGFB參與PM2.5抑制的iWAT棕色化。
使用CL316243上調ADRB3信號的小鼠模型和ADRB3過表達的3T3-L1細胞模型，證明ADRB3的激活和過表達均顯著上調了3T3-L1脂肪細胞中PTG的蛋白表達水平和糖原含量，同時顯著下調了VEGFB的蛋白表達水平。進一步研究表明，在ADRB3激動劑處理的小鼠模型和ADRB3過表達的細胞模型中，PM2.5下調的PTG蛋白水平均被顯著逆轉。類似地，PM2.5暴露顯著上調的VEGFB蛋白表達也被ADRB3激活和過表達所逆轉。然而，PTG過表達并未改變iWAT或脂肪細胞中ADRB3的蛋白水平。總之，這些結果表明ADRB3可能作為PTG的上游調節因子，正向調節PTG表達，繼而抑制VEGFB表達。
隨后全面評估了增強ADRB3活性對PM2.5暴露小鼠iWAT棕色化的影響。在FA和PM2.5暴露條件下，ADRB3激活均顯著上調了小鼠iWAT中Ucp1、CD137、Dio2和Cidea的mRNA表達水平。蛋白質印跡進一步證實，增加的ADRB3活性不僅顯著提高了小鼠iWAT中UCP1的蛋白水平，而且有效逆轉了PM2.5暴露誘導的UCP1蛋白表達下調。
在3T3-L1脂肪細胞中，ADRB3過表達顯著上調了Ucp1、CD137、Dio2和Pgc1α的mRNA水平。此外，它有效逆轉了PM2.5暴露引起的Ucp1、CD137、Cox8b和Pgc1α基因表達下降。蛋白質印跡進一步證實ADRB3過表達顯著增加了3T3-L1脂肪細胞中UCP1的蛋白水平，并減輕了PM2.5暴露誘導的下調。這些發現表明ADRB3激活和過表達可通過PTG-VEGFB信號通路改善PM2.5暴露誘導的iWAT棕色化功能障礙。
3 討論
本研究提供了關于PM2.5暴露如何破壞糖原代謝以抑制iWAT棕色化的機制見解，為解決PM2.5相關代謝紊亂提供了新視角。基于作者先前證明PM2.5誘導iWAT棕色化抑制和代謝功能障礙的發現，本研究現在提出以下關鍵發現：PM2.5暴露顯著損害iWAT中的糖原代謝。PTG過表達不僅挽救了PM2.5誘導的iWAT糖原代謝失調，而且減輕了iWAT中的產熱損傷、線粒體功能障礙和棕色化能力受損，以及全身代謝功能障礙。ADRB3-PTG-VEGFB信號軸是PM2.5誘導代謝缺陷和脂肪棕色化抑制的機制框架。這些發現首次證明PM2.5通過糖原代謝失調破壞脂肪棕色化。重要的是，我們的工作通過強調PTG介導的糖原代謝作為抵消空氣污染暴露代謝后果的核心，揭示了一種新的“污染-剖析-保護”范式。
本研究首次揭示PM2.5暴露顯著損害iWAT中的糖原代謝
