《Advanced Science》：Neddylation Targets and Stabilizes NLRP3 to Augment Inflammasome-Mediated Colitis and Mood Disorder
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本研究揭示了NLRP3炎癥小體激活新機制：neddylation通過K287位點修飾穩定NLRP3，拮抗Trim31介導的K48泛素化降解，從而增強巨噬細胞炎癥反應。研究發現，髓系特異性缺失UBA3或NEDD8可緩解DSS誘導的結腸炎及應激性焦慮，而neddylation抑制劑MLN4924通過抑制NLRP3炎癥小體活化發揮治療潛力。該工作為炎癥相關疾病提供了新的治療靶點。
2.1 Neddylation促進巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活
研究發現髓系特異性缺失UBA3（NEDD8活化酶E1的催化亞基）或NEDD8的小鼠，其骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）在LPS+ATP或LPS+MSU刺激后，IL-1β分泌顯著減少，而TNF-α和IL-6分泌無變化。轉錄組分析和qRT-PCR證實NLRP3、pro-IL-1β等mRNA水平未受影響，但免疫印跡顯示活化的Caspase-1和GSDMD N端片段生成減少，表明neddylation在轉錄后水平促進NLRP3炎癥小體活化。
2.2 髓系Neddylation阻斷使小鼠對DSS誘導的結腸炎產生抵抗
髓系特異性UBA3缺失（Uba3ΔMye）小鼠在DSS誘導的結腸炎模型中，體重減輕較少，疾病活動指數降低，結腸組織病理損傷減輕，結腸組織中IL-1β水平降低，而TNF-α和IL-6無顯著變化。流式細胞術顯示結腸浸潤巨噬細胞數量無差異，但IB分析表明UBA3缺失小鼠結腸組織中成熟IL-1β水平降低，pro-IL-1β水平不變，證明neddylation通過調控NLRP3炎癥小體活化影響結腸炎。
2.3 小膠質細胞誘導性Neddylation阻斷緩解心理應激誘導的焦慮樣行為
利用他莫昔芬誘導的Cx3cr1-CreERT2; Uba3F/F（Uba3-iKO）小鼠模型，研究發現心理應激（束縛應激）可增強杏仁核中P-JNK、NLRP3和成熟IL-1β水平，并導致突觸蛋白Synaptophysin和PSD-95減少。而小膠質細胞特異性缺失UBA3可緩解應激誘導的焦慮樣行為（高架十字迷宮和曠場實驗），減少杏仁核中小膠質細胞標志物Iba1與M1極化標志物CD68的共標，降低成熟IL-1β水平，并緩解突觸損失。
2.4 Neddylation維持NLRP3的蛋白水平
機制探討發現，UBA3缺失并不影響NLRP3激動劑誘導的ROS生成，但增強JNK磷酸化。意外的是，UBA3或NEDD8缺失的BMDMs中NLRP3蛋白水平降低，而其mRNA水平不變。在DSS結腸炎模型和束縛應激模型的結腸組織及杏仁核組織中均觀察到NLRP3蛋白水平降低，mRNA無變化。臨床結腸炎組織樣本免疫組化顯示NEDD8與NLRP3水平呈正相關，提示neddylation在體內外均能穩定NLRP3蛋白。
2.5 NLRP3是Neddylation底物
通過組氨酸拉下實驗證實，在HEK-293T細胞中過表達的Myc-NLRP3可被His-NEDD8共價修飾，且可被MLN4924抑制。在6×His-FLAG-NEDD8敲入小鼠的BMDMs中，內源性NLRP3存在neddylation修飾，而ASC、pro-Caspase-1、GSDMD和pro-IL-1β未檢測到。質譜分析和點突變驗證表明K287是主要neddylation位點。進一步研究發現Ube2M是neddylation E2，Smurf2是neddylation E3，它們與NLRP3相互作用，并促進其neddylation。
2.6 NLRP3的Neddylation拮抗其泛素化和降解
蛋白酶體抑制劑MG132可逆轉UBA3缺失或MLN4924處理導致的NLRP3蛋白水平下降。Neddylation缺陷突變體K287R的蛋白水平低于野生型，且MLN4924處理不再影響其水平。在HEK-293T細胞中，MLN4924處理或K287R突變均抑制了NLRP3炎癥小體的活化。機制上，neddylation阻斷增強了內源性NLRP3的泛素化，特別是K48連接的多聚泛素化。Smurf2作為neddylation E3，并不介導K48泛素化，而Trim31作為K48泛素化E3，其與NLRP3的相互作用在neddylation阻斷后增強，且能促進K287R突變體的泛素化。在UBA3缺失的BMDMs中敲低Trim31可部分恢復NLRP3蛋白水平及炎癥小體活化，表明neddylation通過阻礙Trim31招募來抑制NLRP3的K48泛素化降解。
2.7 MLN4924緩解心理應激誘導的小膠質細胞炎癥激活和焦慮樣行為
體內實驗表明，腹腔注射50 mg/kg MLN4924可緩解束縛應激誘導的小鼠焦慮樣行為，減少杏仁核中小膠質細胞Iba1和CD68的共標，降低NLRP3和成熟IL-1β蛋白水平，并緩解突觸蛋白的丟失。這表明抑制neddylation具有治療應激相關精神疾病的潛力。
3 討論
本研究首次確認NLRP3是真正的neddylation底物，其K287位點的neddylation由Ube2M/Smurf2催化，并通過空間阻礙效應抑制Trim31介導的K48泛素化降解，從而穩定NLRP3并促進炎癥小體活化。髓系或小膠質細胞neddylation缺失可緩解小鼠結腸炎和焦慮樣行為。Neddylation抑制劑MLN4924在臨床前模型中顯示出治療潛力，為炎癥性疾病提供了新策略。
