肺纖維化（PF）是慢性進行性間質(zhì)性肺病，以肺實質(zhì)被纖維瘢痕組織替代為特征，導(dǎo)致肺功能下降，通常是慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺損傷的最終階段。PF損害肺功能，導(dǎo)致氣體交換進行性下降，最終可能導(dǎo)致死亡。目前FDA批準(zhǔn)的兩種藥物尼達尼布和吡非尼酮僅能減緩疾病進展，無法治愈疾病，且存在嚴(yán)重副作用。因此，開發(fā)PF新藥迫在眉睫。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是研究最深入的促纖維化細胞因子之一，在PF發(fā)病機制中起核心調(diào)控作用。Smad2和Smad3是促進TGF-β1介導(dǎo)PF的主要下游調(diào)節(jié)因子。激活的TGF-β1-Smad2/3信號通路誘導(dǎo)成纖維細胞增殖和活化，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，刺激促炎和促纖維化細胞因子表達，從而加速PF進程。因此，靶向TGF-β1可能是保護PF過程中正常肺結(jié)構(gòu)的有效策略。傳統(tǒng)中藥一直是藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源。巖蒿（Artemisia rupestris L.）是蒿屬多年生草本植物，廣泛分布于中國新疆，作為中藥具有抗炎、抗病毒和腎臟保護作用。近期研究表明，巖蒿通過抑制MAPK/NF-κB信號通路和NO等炎癥因子表達來抑制肺部炎癥。然而，巖蒿是否具有抗纖維化特性尚未被研究。

研究首先評估了EEAR對CS暴露誘導(dǎo)的肺損傷的保護作用。CS暴露組小鼠體重顯著減輕，EEAR預(yù)處理組小鼠體重迅速恢復(fù)，而長期地塞米松（DEX）治療導(dǎo)致體重顯著減輕，顯示DEX的不良反應(yīng)。H&E染色顯示EEAR改善了CS誘導(dǎo)的炎癥細胞浸潤、氣道閉合和氣道重塑。EEAR抑制了肺中IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。此外，EEAR顯著降低了CS誘導(dǎo)的肺分泌粘液蛋白MUC5AC的增加，表明EEAR可緩解CS誘導(dǎo)的氣道阻塞。微CT結(jié)果顯示EEAR降低了肺密度，防止了CS誘導(dǎo)的肺實變。動脈血氣分析顯示EEAR顯著改善了CS暴露導(dǎo)致的PaO₂水平下降和PaCO₂水平升高，緩解了肺損傷所致肺氣體交換功能障礙。這些發(fā)現(xiàn)表明EEAR顯著抑制PF、肺部炎癥和氣道阻塞，從而減輕COPD中的肺損傷并改善血氧水平。

Masson染色顯示CS誘導(dǎo)肺氣道周圍藍色染色的膠原纖維增加，EEAR緩解了這種增加。免疫熒光（IF）標(biāo)記α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，肌成纖維細胞標(biāo)志物）和膠原蛋白I（膠原纖維標(biāo)志物）顯示，EEAR抑制了CS誘導(dǎo)的氣道上皮細胞中α-SMA的上調(diào)和肺中膠原蛋白I的上調(diào)，以及纖連蛋白mRNA，從而緩解EMT和膠原沉積。EVG染色顯示CS暴露導(dǎo)致氣道周圍彈性纖維縮短和增厚，EEAR改善了此現(xiàn)象。同時，EEAR抑制了CS誘導(dǎo)的肺氣道和肺組織中MMP-2分泌增加。EEAR顯著抑制了TGF-β1 mRNA表達的上調(diào)，表明TGF-β1是EEAR抗纖維化作用的潛在治療靶點。因此，EEAR通過抑制MMP-2表達、緩解EMT、膠原沉積和彈性纖維分布不均來改善PF。

為探討EEAR作用機制，研究使用香煙煙霧提取物（CSE）處理的人支氣管上皮細胞（Beas-2B）建立體外模型。EEAR在1.25、2.5和5 mg/mL濃度下提高了CSE誘導(dǎo)的Beas-2B細胞活力。EEAR顯著抑制了CSE誘導(dǎo)的TGF-β1蛋白和mRNA表達增加。CSE刺激后p-Smad2/3和Smad2/3顯著增加，但EEAR處理組蛋白水平降低。同時，EEAR阻止了CSE誘導(dǎo)的Beas-2B細胞中α-SMA和纖連蛋白的增加。CSE誘導(dǎo)的Beas-2B細胞中膠原蛋白I的熒光強度與EEAR劑量負(fù)相關(guān)。在Beas-2B細胞中，EEAR抑制了CSE誘導(dǎo)的MMPs（MMP-2和MMP-12）及其活性調(diào)節(jié)蛋白（PAI-1和TIMP-1）的分泌。傷口愈合實驗顯示EEAR阻止了CSE誘導(dǎo)的Beas-2B細胞遷移。這些結(jié)果表明EEAR通過抑制TGF-β1-Smad2/3信號通路預(yù)防EMT和膠原沉積。

通過LC-MS分析EEAR成分，在正負(fù)離子模式總離子流圖中檢測到EEAR含87種化合物，包括32種黃酮類、18種有機酸、15種苯丙酮類和8種倍半萜類。通過保留時間和質(zhì)譜MS2碎片鑒定出RA、7-羥基香豆素、亞麻苷、白楊素B、青蒿素、D-(-)-奎尼酸、綠原酸、安布羅酸和甘草次酸等為EEAR成分。利用生物層干涉術(shù)（BLI）和LC-MS篩選鑒定EEAR中結(jié)合TGF-β1的化合物，發(fā)現(xiàn)活性成分是RA。RA以單電荷去質(zhì)子化離子形式存在（[M-H], m/z 247.13），其MS2碎片主要產(chǎn)生m/z 203.14。通過定量分析RA標(biāo)準(zhǔn)品和EEAR樣品的洗脫峰，確定EEAR含1.26% RA。分析小鼠血液和肺組織代謝成分，血液中鑒定出37種天然化學(xué)化合物，肺組織中鑒定出16種，且血液中大量RA轉(zhuǎn)移至肺組織。這些結(jié)果表明EEAR中結(jié)合TGF-β1的成分是RA，其可通過代謝進入肺組織。

表面等離子共振（SPR）分析顯示RA（3.125–70 μg/mL）以濃度依賴方式直接與TGF-β1相互作用，平衡解離常數(shù)（K_D）為26.64 μg/mL。細胞熱位移分析（CETSA）表明RA顯著保護TGF-β1蛋白免于溫度依賴性變性，證實RA直接結(jié)合TGF-β1蛋白。分子對接預(yù)測RA與TGF-β1蛋白（PDB: 1KLA）的GlyA46殘基結(jié)合，結(jié)合能得分為-5.31 kcal/mol。分子動力學(xué)模擬顯示TGF-β1/RA的均方根偏差（RMSD）穩(wěn)定在0.3–0.4 nm，TGF-β1的RMSD穩(wěn)定在0.2–0.3 nm，表明TGF-β1/RA與TGF-β1之間存在明顯構(gòu)象變化。同時，TGF-β1/RA的均方根波動（RMSF）相對較低，多數(shù)序列RMSF低于0.2 nm，表明蛋白系統(tǒng)相對穩(wěn)定。TGF-β1/RA復(fù)合物結(jié)合能為-20.66 ± 2.16 kcal/mol。將RA（50 μg/mL）與TGF-β1（5 ng/mL）體外預(yù)混合1小時后誘導(dǎo)Beas-2B細胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)的Beas-2B細胞中TGF-β1蛋白泛素化增加，但RA-TGF-β1混合物處理降低了泛素化，但不影響TGF-β1 mRNA。Western blot顯示RA-TGF-β1混合物誘導(dǎo)的Beas-2B細胞中TGF-βR1、TGF-βR2和p-Smad2/3蛋白表達顯著降低。這些數(shù)據(jù)直接證明RA通過結(jié)合TGF-β1抑制其泛素化并改變構(gòu)象，阻止下游信號通路激活。α-SMA蛋白、膠原蛋白I蛋白和纖連蛋白mRNA表達被抑制。同時，RA-TGF-β1混合物抑制了MMP-2、MMP-12、TIMP-1和PAI-1的表達，并抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的Beas-2B細胞遷移。總之，RA通過結(jié)合TGF-β1抑制其泛素化和構(gòu)象改變，從而抑制TGF-β1-Smad2/3信號通路，進一步抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和膠原沉積，改善PF。

為驗證RA是否通過TGF-β1介導(dǎo)其效應(yīng)，使用三種不同短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低TGF-β1表達。shTGF-1、shTGF-2和shTGF-3顯著降低Beas-2B細胞中TGF-β1水平。結(jié)果表明RA抑制CSE誘導(dǎo)的TGF-β1上調(diào)，從而抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路激活。該激活信號通路促進下游蛋白包括膠原蛋白I、α-SMA、MMP-2、MMP-12、TIMP-1和PAI-1以及纖連蛋白mRNA的表達，最終增強Beas-2B細胞遷移。然而，TGF-β1敲低后，RA抑制CSE誘導(dǎo)的TGF-β1/Smad2/3通路激活的能力顯著降低，且RA對這些下游蛋白、纖連蛋白mRNA和細胞遷移的抑制作用減弱。同時，將TGF-β1上的GlyA46位點突變?yōu)楸�氨酸。傷口愈合實驗顯示RA顯著抑制轉(zhuǎn)染野生型TGF-β1質(zhì)粒的Beas-2B細胞遷移，而其抑制作用在轉(zhuǎn)染突變型TGF-β1質(zhì)粒的細胞中減弱。此外，RA失去了抑制突變型TGF-β1誘導(dǎo)的TGF-β1/Smad2/3信號通路激活的能力，但有效抑制了野生型TGF-β1誘導(dǎo)的激活。RA顯著抑制野生型TGF-β1誘導(dǎo)的下游蛋白包括膠原蛋白I、MMP-12、MMP-2、PAI-1、TIMP-1和α-SMA的上調(diào)，但未能抑制突變型TGF-β1誘導(dǎo)的下游蛋白和纖連蛋白mRNA表達增加（除MMP-2和MMP-12外）。因此，TGF-β1及其GlyA46殘基是RA抑制EMT和膠原沉積的直接靶點。

為研究RA對PF中EMT和膠原沉積的抑制作用，建立了CSE體外模型。細胞活力實驗顯示RA在12.5、6.25和3.125 μg/mL濃度下提高細胞活力，阻止CSE誘導(dǎo)的細胞活力下降。研究TGF-β1-Smad2/3信號通路以確定RA機制，發(fā)現(xiàn)CSE顯著增加p-Smad2/3和Smad2/3表達水平，而RA處理細胞表現(xiàn)出降低的p-Smad2/3和Smad2/3水平，表明RA阻止了TGF-β1-Smad2/3信號通路激活。同時，通過測量α-SMA、纖連蛋白和膠原蛋白I（PF的肌成纖維細胞標(biāo)志物）表達來檢查纖維化反應(yīng)，結(jié)果顯示RA抑制了CSE誘導(dǎo)的Beas-2B細胞中α-SMA和膠原蛋白I的表達以及纖連蛋白mRNA表達。同時，RA降低了MMP-2、MMP-12、TIMP-1和PAI-1蛋白的產(chǎn)生，從而抑制CSE誘導(dǎo)的Beas-2B細胞遷移。這些結(jié)果表明RA通過TGF-β1/Smad2/3信號通路預(yù)防CSE誘導(dǎo)的EMT和膠原沉積，緩解PF。

PF導(dǎo)致COPD中不可逆的肺損傷，每年在全球?qū)е聰?shù)百萬人死亡和巨額醫(yī)療費用，對公共健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。中藥作為炎癥和纖維化有效且安全的治療方法，日益成為預(yù)防COPD中PF的焦點。巖蒿作為傳統(tǒng)中藥，具有清肺、潤肺和抗炎作用，但其抗纖維化特性從未被研究。本研究探討了EEAR對CS誘導(dǎo)的COPD中PF的作用和機制。在COPD中，PF是肺實變的關(guān)鍵因素，損害肺功能并加重氣流受限。本研究建立CS誘導(dǎo)的小鼠模型研究EEAR的抗纖維化活性及其作為PF新療法的潛力。結(jié)果表明，CS誘導(dǎo)的PF小鼠模型具有與人類PF相似的特征，如體重減輕、氣道阻塞、肺功能障礙和膠原沉積。EEAR顯著預(yù)防炎癥、氣道阻塞和膠原沉積。然而，DEX作為肺部炎癥和PF的常用治療方法，對CS暴露小鼠的氣道阻塞、肺功能和膠原沉積無顯著保護作用。此外，EEAR通過防止CS暴露導(dǎo)致的肺密度增加、提高PaO₂水平和降低PaCO₂水平顯著改善肺功能。研究表明 prolonged inflammatory infiltration induces EMT and subsequent activation in epithelial cells, increasing Collagen I, α-SMA, MMP-12, and MMP-2 expression, leading to PF and exacerbating COPD。此外，TIMP-1和PAI-1是調(diào)節(jié)MMPs酶活性的重要因子。本研究發(fā)現(xiàn)EEAR阻止了CS暴露引起的MMP-12和MMP-2過表達，減少細胞外基質(zhì)（ECM）降解，平衡肺組織中彈性纖維和膠原纖維，從而抑制PF。EEAR還阻止CSE誘導(dǎo)的Beas-2B細胞EMT，抑制膠原蛋白I、α-SMA、MMP-12、MMP-2、TIMP-1和PAI-1蛋白表達增加。總之，本研究表明EEAR是PF安全有效的治療方法。為確定EEAR抗纖維化作用機制，進行了全面詳細分析。炎癥通過TGF-β1和NF-κB信號通路串?dāng)_增強TGF-β1過表達，從而促進PF發(fā)展。此外，在炎癥刺激下，TGF-β1促進Smad蛋白與MUC5AC啟動子結(jié)合，增加MUC5AC分泌、氣道阻塞和氣流受限，進一步限制肺功能。總之，研究表明TGF-β1在抑制PF中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)EEAR通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad2/3信號通路預(yù)防COPD中的PF并抑制肺實變。此外，它減輕了肺部炎癥和過度MUC5AC表達引起的氣道阻塞，改善肺功能。中藥活性成分不明限制了其治療COPD中PF的應(yīng)用。識別和篩選中藥提取物中治療COPD的化學(xué)成分對臨床藥物開發(fā)至關(guān)重要。與既往研究一致，本研究證實巖蒿主要含黃酮類、有機酸和倍半萜類。通過分析血液中天然化學(xué)成分，RA、A2-A31和P1-P6被鑒定為EEAR的潛在活性成分。肺組織天然化學(xué)成分分析顯示，肺中含量高的活性成分是RA、A4、A18、A8和A32，其中RA濃度最高。TGF-β1是研究最深入的促纖維化細胞因子，在PF發(fā)病機制中起核心調(diào)控作用。敲低實驗證明TGF-β1是CSE誘導(dǎo)PF的關(guān)鍵蛋白。因此，靶向TGF-β1是保護PF過程中正常肺結(jié)構(gòu)的有效策略。此外，前期結(jié)果表明EEAR通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad2/3信號通路預(yù)防PF并抑制肺實變。因此，利用BLI和LC-MS篩選鑒定EEAR中結(jié)合TGF-β1的化合物，鑒定出EEAR中結(jié)合TGF-β1的活性成分RA。進行SPR和CETSA分析量化RA與TGF-β1的相互作用。此外，進行分子對接分析和分子動力學(xué)模擬闡明RA與TGF-β1的結(jié)合模式。RA與TGF-β1中的GlyA46相互作用，蛋白突變實驗進一步支持。分子動力學(xué)模擬顯示RA誘導(dǎo)TGF-β1構(gòu)象變化，可能導(dǎo)致蛋白功能改變。體外實驗進一步證實RA通過結(jié)合TGF-β1抑制其泛素化和構(gòu)象改變，從而抑制TGF-β1-Smad2/3信號通路。最后，研究表明RA通過TGF-β1/Smad2/3信號通路預(yù)防CSE誘導(dǎo)的EMT和膠原沉積，緩解PF。總之，這些數(shù)據(jù)直接證明RA通過結(jié)合TGF-β1預(yù)防PF。

本研究深化了對巖蒿預(yù)防PF和改善COPD肺損傷作用的理解，表明EEAR通過TGF-β1/Smad2/3信號通路預(yù)防CS誘導(dǎo)的EMT、纖維失衡，逆轉(zhuǎn)膠原蛋白I、α-SMA、MMP-2、MMP-12、TIMP-1和PAI-1蛋白表達增加，從而預(yù)防COPD中的PF。鑒定出EEAR中結(jié)合TGF-β1的活性成分RA。RA通過抑制TGF-β1蛋白泛素化和改變構(gòu)象調(diào)節(jié)TGF-β1-Smad2/3信號通路，從而抑制EMT和膠原沉積，治療PF。因此，巖蒿及其活性成分RA是治療COPD中PF的潛在臨床藥物，這些發(fā)現(xiàn)為COPD管理治療藥物的研發(fā)提供了參考。