隨著全球人口預計在2050年達到98億，對糧食供應的需求將持續增長。農藥在控制雜草和病原體以實現有效作物保護和農業生產方面發揮著至關重要的作用。然而，農藥的不當使用也導致了諸如農藥抗性等問題。為了應對這些挑戰，發現新靶點和設計具有新作用模式的綠色化學結構日益受到關注。隨著比較基因組學的快速發展，我們期望利用這一工具尋找跨物種（如植物和病原真菌）的進化保守靶點，以設計兼具除草和殺菌特性的雙靶點化合物——更精確地說，這是一種通過靶點組結構相似性分析設計廣譜農用化學品的策略。

發現此類新型雙靶點化合物的一個 promising 途徑是植物中必需的類胡蘿卜素生物合成途徑。類胡蘿卜素是一類廣泛存在于光合生物（包括植物、藻類和藍細菌）中的類異戊二烯代謝物。在植物中，類胡蘿卜素及其衍生物對光合作用和光保護至關重要。阻斷類胡蘿卜素生物合成會誘導葉綠素的氧化分解，在植物中表現出白化表型，最終導致植物死亡。由于類胡蘿卜素合成途徑是植物所獨有的，該途徑中的關鍵限速酶有潛力被開發為綠色農藥靶點。作為一個關鍵的限速酶，八氫番茄紅素合酶（PSY）催化類胡蘿卜素生物合成途徑的第一步，隨后是八氫番茄紅素脫飽和酶（PDS）和ζ-胡蘿卜素脫飽和酶（ZDS）。迄今為止，已有七種靶向PDS的商業漂白除草劑（如氟啶酮和氟吡呋喃）被廣泛使用。此外，位于PDS下游的ZDS也顯示出設計漂白除草劑的潛力。在整個類胡蘿卜素生物合成途徑中，我們注意到PSY通過多種調控在控制類胡蘿卜素總量方面起著限速作用。PSY活性的失調將嚴重影響類胡蘿卜素積累和植物生長。

由于PSY參與類胡蘿卜素生物合成途徑的第一步，PSY同源物的結構在其他物種中可能也是進化保守的。通過對不同物種中PSY同源物的多序列比對，我們發現PSY不僅在植物中高度保守，而且與真菌和細菌中的角鯊烯合酶共享一個保守的異戊二烯基轉移酶結構域。在真菌中，角鯊烯合酶（erg9）與PSY表現出極大的結構和催化底物相似性，而在細菌中，則是脫氫角鯊烯合酶（CrtM）。值得注意的是，erg9是真菌中麥角固醇合成的關鍵限速酶，麥角固醇對于決定膜流動性、通透性和膜相關蛋白活性的真菌細胞膜至關重要。如果麥角固醇生物合成途徑被阻斷，也將限制病原真菌的生長。這些證據暗示，有可能從PSY的晶體結構開發出一種兼具除草和殺菌活性的雙靶點藥劑。據我們所知，尚未有報道靶向PSY結構域且具有除草和殺菌特性的藥劑。

作為基于PSY同源物開發雙靶點抑制劑的的概念驗證，我們首先通過多序列比對確認了PSY和erg9在不同物種間的結構相似性。隨后分別使用病毒誘導的基因沉默（VIGS）和CRISPR-Cas9基因敲除進一步研究了PSY在植物中和erg9在真菌中的生理功能。然后利用PSY結構進行虛擬篩選和結構優化，獲得了具有除草和殺菌活性的先導化合物1c。通過體外和植物體內分析全面研究了1c的作用模式（MOA）。所有這些結果表明，1c是一種兼具除草和殺菌活性的雙靶點化合物。

為了評估PSY作為新型除草劑靶點的潛力，我們基于氨基酸序列對NCBI數據庫中所有可用的植物PSY同源物進行了多序列比對。151種種子植物中PSY的序列相似性超過50%，且大多數植物的相似性甚至超過70%，表明其具有高度的進化保守性。為了研究開發雙靶點抑制劑的潛力，我們擴展了分析以識別非植物物種中的PSY同源物。該分析發現了PSY與兩種蛋白質之間的顯著相似性：真菌中的角鯊烯合酶（erg9）和細菌中的脫氫角鯊烯合酶（CrtM）。重要的是，erg9是麥角固醇生物合成（真菌膜的基本組成部分）中的限速酶，而CrtM對于細菌中毒力因子葡萄球菌黃素的合成至關重要，這使得它們分別成為經過驗證的殺菌劑和抗菌劑靶點。

我們接下來比較了PSY、erg9和CrtM的功能和結構相似性。它們的催化反應具有高度相似性。此外，盡管整體序列相似性僅為27.29%，但它們的三級結構高度相似，PSY/erg9和PSY/CrtM之間的RMSD值較低。系統發育分析顯示，PSY和erg9屬于系統發育樹中的同一亞支，分支位置相鄰，表明它們之間存在密切的進化關系。我們在PSY活性位點內識別出三個保守基序，這些基序也存在于erg9和CrtM中。關鍵的是，關鍵的催化殘基分布在這些基序內。這些發現為開發作用于PSY和erg9的雙靶點抑制劑提供了堅實的結構基礎。

為了驗證進化相關的酶PSY（在植物中）和erg9（在真菌中）作為雙靶點抑制劑靶點的潛力，我們采用了并行的遺傳學策略。在擬南芥中，同時使用病毒誘導的基因沉默（VIGS）和CRISPR-Cas9介導的敲除來驗證PSY的關鍵作用。在靶基因沉默效率超過90%的前提下，僅在沉默PSY、PDS和ZDS后，擬南芥葉片中的葉綠素含量顯著下降（與對照組相比約下降80%）。PSY沉默組擬南芥幼苗的地上部分鮮重下降了約85%，略優于PDS沉默組（70%），與ZDS沉默組相當。在分別沉默PSY、PDS和ZDS的處理組中，葉綠素含量、花莖高度、蓮座叢分枝數和主干分枝數無顯著差異。隨后，使用CRISPR-Cas9介導的敲除，我們獲得了幾種PSY和PDS突變體，并通過白化葉片的存在和Sanger測序進行了確認。與野生型幼苗相比，PSY和PDS敲除突變體均表現出嚴重的生長受損，這歸因于缺乏有效的光合作用。

類似地，在酵母中，CRISPR-Cas9介導的erg9敲除是致死的，這通過幾乎完全沒有存活菌落來證明，而引入同義突變或插入終止密碼子的對照實驗證實致死性特異性地是由于蛋白質功能喪失所致。這一直接的遺傳學證據確定，PSY和erg9對于各自生物的生存都是必需的，最終驗證了它們是開發具有除草和殺菌活性的單一藥劑的高價值靶點。

在遺傳學上驗證了PSY和erg9作為必需靶點后，我們試圖鑒定一個候選的雙靶點先導化合物用于結構優化。我們基于分子對接對擬南芥PSY（AtPSY）結構進行了包含21萬個化合物的庫的高通量虛擬篩選。基于分子量、脂水分配系數、結合親和力和結構特征的連續過濾將候選物縮小到43個化合物。對稗草和油菜的生物活性測定鑒定出兩個活性命中化合物（化合物14和33），它們含有1,2,4-三唑環部分。化合物14和33在100 μg/mL濃度下對油菜種子的抑制活性超過80%，而在相同劑量下對稗草的抑制活性分別為35.5%和73.4%。藥效團分析和基于結構的設計導致選擇了先導化合物1a。

我們隨后通過表面等離子共振（SPR）親和力（K_D為132.7 μM）和有利的對接結合能（-8.9 kcal/mol）確認了1a與AtPSY的結合。接下來，我們評估了化合物1a的生物活性。在此，使用最廣泛使用的類胡蘿卜素生物合成途徑靶向除草劑（靶向PDS）氟吡呋喃作為除草活性評估和白化表型分析的陽性對照。關鍵的是，1a表現出與PSY抑制一致的生物活性，在擬南芥中引起與除草劑氟吡呋喃相當的白化表型，并對禾谷鐮刀菌的生長抑制約50%。分子對接顯示，1a通過關鍵相互作用結合在AtPSY內的一個疏水空腔中：其間位三氟甲基苯基部分與Phe146等殘基發生疏水和π-π堆積相互作用，而其芐硫基部分與由Ala255和Val258形成的疏水區域結合。三唑環氨基與位于弱極性環境中的Ser370之間形成的關鍵氫鍵進一步穩定了結合。保守性分析顯示這些相互作用的殘基在物種間高度保守，支持了1a作為進一步優化的廣譜、雙效模板的潛力。

根據先導化合物1a與AtPSY的分子對接結果，我們進行了構效關系研究，以改善其類藥性、生物活性和親水性。我們基于以下優化策略設計并合成了三個系列的28個類似物：（1）鹵素取代：為了研究鹵素類型和位置的影響，我們在三唑環5位支鏈苯環的不同位點引入了氯、溴或碘原子，得到化合物1a-5a和9a-15a。（2）電子和空間效應：為了探究電子和空間影響，我們在同一支鏈苯環上引入了吸電子基團（NO₂, CF₃）和供電子基團（CH₃）。（3）側鏈延長：為了評估增加極性和構象靈活性的效果，我們在三唑環與其5位支鏈苯環之間插入了一個羰基，創建了類似物1b-4b。（4）4位苯環的修飾：為了進行比較，我們在位于三唑環4位的苯環上的不同位置引入了氯原子，生成化合物1c-9c。所有合成的化合物均通過¹H NMR、¹³C NMR、¹⁹F NMR和高分辨率質譜（HRMS）進行了充分表征。

生物學篩選鑒定出幾種具有顯著活性的化合物。針對六種雜草的除草活性測定顯示，雖然許多化合物無活性，但類似物2b、3b，尤其是6c在750 g a.i./ha的劑量下表現出強效作用。化合物6c表現出卓越的廣譜除草活性，抑制所有六種測試雜草（抑制率80%–100%），優于陽性對照氟吡呋喃。同時，殺菌活性篩選顯示，其他類似物，如1c，對多種病原真菌（梨生殼多孢菌、灰葡萄孢菌、茄鏈格孢菌、核盤菌和落花生尾孢菌）表現出強效、廣譜的抑制活性（>60%），與百菌清相當。值得注意的是，幾種具有除草活性的化合物（5a, 11a, 2b, 3b, 6c）也顯示出殺菌活性，例如6c和11a對灰葡萄孢菌的抑制率為60%。

盡管1c在最初的溫室試驗中活性較弱，但使用茄鏈格孢菌對其進行了進一步研究。它表現出劑量依賴性的真菌生長抑制，并引起菌絲干燥和破裂，這與麥角固醇生物合成抑制一致。當在擬南芥上重新評估時，1c誘導了特征性的白化漂白表型，并導致顯著的幼苗死亡率，證實它也具有強效的除草活性。1c的鑒定證實了雙靶向保守的PSY/erg9的可行性。

1c的活性被證實源于其對PSY和erg9的直接抑制。體外結合測定證明1c以高親和力結合PSY（K_D= 45.0 ± 24.1 μM）。類似地，1c對erg9也具有高靶點結合能力（K_D= 46.5 ± 9.8 μM）。相比之下，MBP標簽未顯示與1c的結合親和力，排除了MBP標簽可能的干擾效應。同時，差示掃描熒光法（DSF）和熱位移測定（TSA）表明這種結合改變了蛋白質的構象并降低了其穩定性。這種抑制隨后通過1c處理的植物中PSY底物牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸的顯著積累得到功能驗證——這種效應在PDS抑制劑氟吡呋喃處理中未觀察到。1c對類胡蘿卜素途徑的阻斷引發了活性氧（ROS）的爆發和隨之而來的超氧陰離子清除能力的下降。這種氧化應激伴隨著抗氧化酶（如過氧化物酶POD和過氧化氫酶CAT）活性的短暫增加，最終導致葉綠素分解、特征性的白化表型和植物死亡。

為了深入了解1c的作用模式，我們進行了轉錄組和代謝組分析。轉錄組分析顯示，1c處理顯著改變了擬南芥幼苗中5260個基因的表達，包括2603個上調和2657個下調的差異表達基因（DEGs）。隨后使用不同數據庫（GO和KEGG）對DEGs進行注釋，以分類CK組和1c處理組之間DEGs的功能。通路富集分析表明，1c處理后的DEGs在芥子油苷生物合成和核糖體通路中顯著富集，這些通路對植物生長至關重要。正如預期，類胡蘿卜素生物合成通路是最顯著富集的，與光合作用膜和天線蛋白相關的基因被強烈下調，證實了光合作用受到嚴重抑制。12個DEGs（涉及三個代謝通路）的表達水平也通過RT-qPCR進行了驗證。此外，值得注意的是，參與核糖體以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路的基因均被1c顯著改變。GO富集分析進一步表明，DEGs最豐富的條目富集在細胞組分中，如葉綠體類囊體、光合作用膜、葉綠體類囊體膜和葉綠體類囊體腔。

代謝組分析進一步證實了類胡蘿卜素途徑的崩潰，顯示了對光合作用至關重要的下游代謝物（包括α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和葉黃素）的急劇減少。總的來說，這些多組學數據描繪了一個全面的機制：1c抑制PSY，破壞類胡蘿卜素和葉綠素代謝，抑制光合作用，并誘導致命的氧化損傷。

為了理解其雙重除草和殺菌活性的結構基礎，我們進行了分子動力學（MD）模擬，以分析活性化合物1c和6c與其靶標PSY和erg9的結合。在50 ns的模擬過程中，兩種化合物都穩定地結合在各自蛋白質的活性位點內。結合自由能的計算顯示，當與PSY結合時，1c和6c顯示出相似結合能；而當與erg9結合時，1c顯示出比6c更低的結合能。MM/GBSA能量顯示，1c與erg9的范德華力（ΔE_VDW）和靜電能量（ΔE_ele）高于6c的相應值，這表明1c與erg9的結合親和力優于6c。1c與erg9的這種更優越的結合，主要由更有利的范德華力和靜電相互作用驅動，為其相較于6c增強的殺菌效力提供了分子層面的解釋。

對平均模擬構象的分析表明，兩種化合物在同一蛋白質內共享高度相似的結合模式。在PSY中，Phe146的側鏈與1c和6c的苯環形成π-π相互作用，Ser262、Ser370以及Tyr374和Asn290的殘基與1c和6c形成靜電相互作用，而Leu359、Val367和Leu286等殘基分別與1c和6c形成疏水相互作用。在erg9中，Phe63、Tyr82、Leu240和Ala205等一堆殘基與1c和6c形成疏水相互作用。與erg9相比，兩種化合物在PSY的口袋內結合得更深。這種現象可能是由于erg9的Phe63和Phe345的空間效應所致，而PSY在相應位點含有Thr145和Leu359殘基，不具有這種效應。

使用MM-GBSA方法進一步分析了化合物1c/6c與PSY/erg9之間結合自由能的分解。在PSY中，對化合物穩定結合貢獻最大的氨基酸殘基是Ala255、Val258、Ala283和Val367。相比之下，在erg9中，Phe63、Val208、Leu212和Leu240表現出比其他氨基酸殘基更低的結合自由能（ΔG_bind超過-1.5 kcal/mol）。這表明由這些氨基酸殘基形成的疏水環境可能在維持三唑環和整個化合物的構象穩定性方面起著至關重要的作用。這些發現描繪了使1c能夠作為強效雙靶點抑制劑的精確相互作用。

開發具有新穎作用模式的新型高效、生態友好型除草劑仍然是對抗日益增長的農藥抗性所必需的，這給作物生產帶來了巨大挑戰。為了解決這個問題，我們提出并驗證了一種新策略：利用跨物種的進化保守蛋白質結構域來設計雙靶點抑制劑。類胡蘿卜素生物合成途徑因其在植物中的重要作用、在動物中的缺失（確保選擇性）以及抑制后產生的易于觀察的白化表型而成為理想的概念驗證。在該途徑中，PSY被確定為首要候選靶點。它是一種高度保守的限速酶，尚無報道的商業抑制劑，并且我們在擬南芥中使用VIGS和CRISPR-Cas9進行的遺傳學驗證證實了其對于植物生存的必要性。關鍵的是，整合比較基因組學（MSA）的生物信息學分析揭示了植物PSY和真菌角鯊烯合酶（erg9）之間的顯著結構相似性，erg9是麥角固醇生物合成中的關鍵酶。在真菌中敲除erg9后觀察到的致死表型促使我們假設：單一化合物可以抑制這兩種酶，從而產生雙重除草和殺菌活性。

在靶點鑒定之后，針對擬南芥PSY結構的高通量虛擬篩選，隨后進行生物活性測定，鑒定出一個含有1,2,4-三唑的先導化合物1a。對該骨架的初步優化產生了兩個關鍵化合物：6c，一種強效的廣譜除草劑；和1c，它表現出期望的雙重除草和殺菌活性。1c與PSY和erg9的結合在體外以低微摩爾親和力得到證實，其功能性抑制通過植物中PSY底物（GGPP）的積累和真菌中類似麥角固醇缺乏的菌絲損傷得到證明。構效關系（SAR）研究表明，引入3,4-二氯苯基對于雙重活性至關重要。基于化合物與靶蛋白之間的相互作用，結合口袋中仍有更多的分子空間來根據來自不同物種的靶蛋白微調生物活性。這些證據也表明，1c可以作為在除草和殺菌活性平衡方面進行進一步優化的雙效先導結構。

通過多方面的系統方法闡明了1c的作用模式。在植物中，PSY抑制引發了一個明確的級聯反應：類胡蘿卜素生物合成的破壞導致活性氧（ROS）爆發、氧化性葉綠素降解（白化）和植物死亡，這通過轉錄組和代謝組分析得到證實。在真菌中，erg9的抑制通過阻斷麥角固醇生物合成損害膜完整性，導致菌絲破裂和細胞死亡。分子動力學模擬為1c的雙靶點能力提供了結構上的理由，顯示其在PSY和erg9的活性位點內都能穩定結合，盡管由于它們結合口袋的差異而具有不同的相互作用譜。根據我們的實驗證據，我們提出了化合物1c作為潛在除草劑和殺菌劑的兩種致死機制。對于除草活性，1c通過選擇性抑制PSY阻礙植物中的類胡蘿卜素生物合成，導致植物葉片中ROS積累，并促進植物出現白化死亡。對于殺菌活性，1c通過選擇性抑制erg9阻斷真菌中的固醇生物合成，破壞真菌膜完整性，導致真菌菌絲破裂并最終死亡。

雖然化合物1c是一個有前景的雙靶點先導化合物，但其更廣泛的應用需要進一步研究。一個關鍵的考慮因素是選擇性：盡管靶向結構域在物種間是保守的，但必須系統地評估1c對作物、有益微生物或其他生物的潛在脫靶效應。此外，由于缺乏針對PSY和erg9的穩健酶學測定方法，對1c作用機制的直接驗證仍然部分受限，阻礙了對酶抑制的定量評估。因此，未來的工作將側重于使用先進的計算工具——例如AlphaFold3、ESM-2、RFdiffusion2和GeoDirDock——來預測和優化化合物在更廣泛物種中的效力和選擇性。這將指導合理設計新的類似物，以增強對目標害蟲的效力，同時最大限度地提高選擇性以避免非目標物種。

據我們所知，這是首次報道具有可證明的雙重除草和殺菌活性的PSY靶向化合物。這種靶向進化保守結構域的策略為開發可調控、有效且能克服抗性的農藥開辟了新途徑。我們預計，這種基于靶點組結構相似性的廣譜農藥設計也將適用于其他關鍵蛋白質，這將指導設計具有可調控選擇性的廣譜農藥，以應對抗性、效力和安全性方面即將到來的挑戰。