番茄果實發育與成熟過程中的血清素代謝調控機制

在植物發育生物學研究領域，番茄（Solanum lycopersicum）作為模式作物為果實成熟機制研究提供了重要平臺。近年研究發現，血清素（serotonin）作為一種色氨酸衍生的吲哚胺類物質，在番茄果實發育過程中積累，可能同時參與植物防御機制和人類營養調節。然而，這種神經活性代謝物在果實成熟過程中的調控機制仍不清楚。本研究通過多學科交叉方法，揭示了MADS-box轉錄因子FUL2與MADS1形成調控模塊，通過直接靶向血清素生物合成通路關鍵基因，精細調控血清素穩態的新機制。

FUL2基因功能缺失突變體的表征分析

為闡明FUL2的生物學功能，研究團隊利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術構建了ful2基因功能缺失突變體（ful2-cr1和ful2-cr2）。在破色期后5天（Br+5），突變體果實呈現獨特的橙色色素沉著，與野生型（WT）果實的均勻紅色形成鮮明對比。雖然ful2-cr1和ful2-cr2突變體果實在成熟后期仍能實現全紅著色，但始終表現出果型減小和表面條紋不規則等典型FUL2缺陷表型。

通過廣靶代謝組學分析發現，ful2-cr1突變體及含有FUL2突變的組合突變體（rin ful2-cr1和rin ful1 ful2-cr1）中血清素積累顯著增加。值得注意的是，rin-cr1、ful1-cr1和rin ful1-cr1品系中的血清素水平與野生型相比無變化，表明FUL2對血清素代謝通路具有獨特的調控作用。靶向定量分析證實，ful2-cr1和ful2-cr2突變體果實中的血清素水平顯著高于野生型，血清素含量升高約10倍，這一發現揭示了FUL2作為果實發育和成熟過程中血清素生物合成轉錄抑制因子的新功能。

FUL2互作蛋白MADS1的功能鑒定

為識別FUL2在果實發育和血清素代謝中的潛在調控伙伴，研究人員構建了CBC啟動子驅動FUL2蛋白表達的轉基因番茄株系。免疫沉淀-質譜聯用（IP-MS）分析鑒定出多個FUL2相關蛋白，包括已知的成熟相關轉錄因子（RIN、FUL1、TAGL1和MADS1）。通過創建各個候選基因的CRISPR/Cas9敲除突變體進行功能表征，發現在Br+10階段，mads1-cr1突變體果實在果型減小方面最接近ful2-cr1突變體表型。

擴展表型分析顯示，mads1-cr1和mads1-cr2均重現了ful2-cr1突變體的關鍵特征，特別是成熟進程延遲和最終果型顯著減小。然而，花序結構表型在ful2-cr和mads1-cr突變體間存在明顯差異：ful2-cr突變體花序發育正常，而mads1-cr1和mads1-cr2突變體每個花序的分枝數顯著增加。轉錄組測序分析發現，ful2和mads1突變體與野生型相比的差異表達基因（DEGs）存在顯著重疊，約58%的MADS1依賴性轉錄本包含在這一共享的DEGs庫中，表明MADS1的調控能力可能需要FUL2活性，兩者可能在一個共同的控制果實發育和成熟的信號網絡中運作。

FUL2與MADS1的物理相互作用驗證

基因組定位分析顯示，FUL2和MADS1位于3號染色體的相鄰位點，并在果實成熟過程中表現出協調的表達模式，隨著成熟進程均呈現表達下調。通過酵母雙雜交（Y2H）實驗證實了FUL2和MADS1之間的直接相互作用。該相互作用在本氏煙（Nicotiana benthamiana）葉片中通過分裂熒光素酶互補（split-LUC）實驗獨立驗證，共表達的FUL2和MADS1融合蛋白產生強烈的發光信號。雙分子熒光互補（BiFC）實驗在本氏煙表皮細胞中證明了FUL2和MADS1的核定位相互作用。利用標簽蛋白進行的天然共免疫沉淀（Co-IP）實驗進一步證實了FUL2和MADS1的物理相互作用。這些結果通過多個獨立實驗確立了FUL2和MADS1作為直接相互作用伙伴。

FUL2-MADS1模塊對血清素生物合成通路的轉錄調控

為闡明FUL2和MADS1控制血清素積累的轉錄網絡，研究人員分析了色氨酸向血清素及其衍生物褪黑素轉化通路中相關基因在突變體與野生型中的表達水平。轉錄組分析顯示，在FUL2和MADS1突變體中，血清素通路基因表達顯著失調。最顯著的是，編碼色氨酸脫羧形成色胺的酶TDC1的表達在FUL2和MADS1突變體中強烈上調；而負責血清素向褪黑素最終轉化的ASMT5表達在突變體中顯著降低，表明代謝流向受損導致血清素積累。這些代謝和轉錄數據支持一個模型，即FUL2和MADS1作為血清素生物合成的主要轉錄調控因子，協調控制通路基因表達以維持番茄果實發育和成熟過程中的血清素穩態。

FUL2全基因組靶基因識別與結合特性

染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析揭示了FUL2結合位點顯著富集CArG-box基序，這是MADS-box轉錄因子的典型DNA識別序列。FUL2 ChIP-seq峰分布分析顯示優先定位于啟動子區域（48%位于轉錄起始點上游2kb內），與其轉錄調控功能一致。將FUL2結合的啟動子與mads1-cr1和ful2-cr轉錄組的差異表達基因（DEGs）進行功能整合，識別出746個共同靶標，包括ASMT5。基因組瀏覽器可視化確認了FUL2在ASMT5啟動子區域的顯著占據，直接將這一結合事件與ful2-cr突變體中觀察到的ASMT5下調聯系起來，確立了FUL2在控制血清素向褪黑素轉化中的作用。

血清素通路基因的定量RT-PCR驗證證實了FUL2的調控作用，顯示在ful2-cr和mads1-cr突變體中TDC1顯著上調和ASMT5下調，與轉錄組譜一致。這些結果證明了FUL2介導的對血清素生物合成中限速酶的轉錄控制。綜合數據支持一個機制模型，即啟動子結合的FUL2通過調控關鍵通路基因，特別是通過抑制ASMT5，來協調代謝流，促進成熟過程中的血清素積累。

FUL2-MADS1復合物對ASMT5的直接轉錄激活

電泳遷移率變動分析（EMSA）使用來自ASMT5啟動子的Cy5標記CArG-box探針顯示，FUL2和MADS1表現出協同DNA結合。雖然單獨使用任一種蛋白均未形成穩定復合物，但它們的組合產生了明顯的條帶偏移。競爭實驗證實了序列特異性，因為結合被野生型而非突變的CArG-box寡核苷酸消除。在本氏煙的雙熒光素酶報告中，共表達的FUL2和MADS1對ASMT5啟動子-LUC報告基因的協同激活證明了功能協同性。這些結果確定FUL2-MADS1異源二聚體通過CArG-box結合直接調控ASMT5表達，為果實發育和成熟過程中的血清素通路控制提供了分子機制。

討論與展望

FUL2（先前命名為MBP7）屬于番茄中FRUITFULL（FUL）轉錄因子亞家族。先前研究表明，FUL2及其旁系同源物FUL1可能獨立地以及與MADS-RIN協同調控番茄果實成熟。雖然單個ful1和ful2 CRISPR/Cas9突變體表現出正常的紅色成熟表型，但ful1 ful2雙突變體顯示嚴重的成熟障礙，揭示了這些旁系同源物之間的遺傳冗余。另一方面，FUL2功能缺失導致果型減小，而FUL1突變體保持野生型果型，揭示了這些旁系同源物在調控果實發育方面的獨特功能作用。ful1和ful2突變體的詳細轉錄組和代謝組分析顯示，細胞壁修飾酶表達譜的協調變化以及與揮發性有機化合物生物合成相關基因的顯著改變，表明這兩個基因可能作為果實營養代謝的調控因子。

關鍵成熟調控突變體的代謝組學分析揭示了血清素積累的獨特模式。雖然ful2-cr單突變體、rin ful2-cr雙突變體和rin ful1 ful2-cr三突變體與野生型相比均表現出顯著升高的果實血清素含量，但rin-cr或ful1-cr單突變體未顯示此類變化。這些發現表明FUL2具有調控血清素代謝的內在能力，這種能力獨立于與MADS-RIN和FUL1的功能相互作用。蛋白質免疫沉淀結合質譜（IP-MS）分析鑒定出MADS1作為FUL2的直接相互作用伙伴，揭示了番茄果實發育網絡中一個先前未表征的調控節點。

MADS1（也稱為EJ2）代表另一個在番茄發育中具有多效性功能的MADS-box轉錄因子。先前研究表明，MADS1作為果實成熟的負調控因子，并在尊片發育過程中高表達。此外，MADS1與MACROCALYX（MC）物理相互作用以調控尊片生長和特性，并通過調控分生組織活性影響花序結構。盡管這些在發育中的作用已確立，但MADS1在初級或特化代謝調控中的潛在參與，特別是在果實成熟過程中，仍然 largely unknown。我們的分析進一步證實了MADS1在花序結構調控中的關鍵作用。mads1-cr突變體每個花序的分枝數顯著增加，每個花序的果實數增多且果型減小。相比之下，ful2-cr突變體影響果型但不增加每個花序的分枝數，表明FUL2和MADS1在果實發育過程中功能保守。先前研究的遺傳證據表明，FUL2和MBP20雙突變體表現出增強的花序分枝，支持FUL2和MBP20在花序形態發生調控中潛在的功能冗余。

FUL2和MADS1是基因組相鄰的基因，具有相似的表達模式。它們在花發育、果型決定和成熟控制中的協調作用可能反映了共同上游因子的共同調控以及發育通路中的功能匯聚。雖然先前研究已確立FUL2作為成熟調控因子，但我們的發現通過揭示其在通過ASMT5抑制血清素生物合成中的直接作用進一步擴展了其功能范圍。這突出了超越經典成熟控制的新調控層，并表明FUL2將發育信號與次級代謝通路整合。

我們的研究闡明了FUL2和MADS1在協調果實發育和成熟過程中的血清素代謝。在番茄中，血清素生物合成通過兩步酶促通路發生：色氨酸脫羧酶（TDC）最初將色氨酸轉化為色胺，隨后被色胺5-羥化酶（T5H）羥基化產生血清素。這種血清素作為調控分子影響多種植物激素介導的生長過程。此外，血清素作為褪黑素的前體，由血清素N-乙酰轉移酶（SNAT）、COMT和ASMT催化其轉化。作為一種多效性信號分子，褪黑素在植物脅迫響應中發揮關鍵作用，包括耐熱性和抵御多種非生物和生物挑戰。發現FUL2-MADS1異源二聚體同時激活ASMT5為成熟過程中觀察到的血清素和褪黑素水平之間的反比關系提供了機制解釋。這種雙重調控能力揭示了核心發育因子可以直接調控代謝通路。

FUL2、MADS-RIN和FUL1共同結合CArG-box基序以調控下游靶基因表達，同時展現出對參與果實發育和營養代謝的特定靶基因的 distinct regulatory specificities。這種多方面的控制系統可能整合了額外的調控組件，包括表觀遺傳因子。例如，DNA甲基化作為一種表觀遺傳機制，通過該機制MADS-RIN通過轉錄激活GAME基因調控甾體糖堿代謝。mads1和ful2突變體果實的比較轉錄組分析顯示差異表達基因（DEGs）存在顯著重疊，58%的MADS1相關DEGs在ful2突變體中共同出現，表明果實發育中的功能互依性。電泳遷移率變動分析（EMSA）進一步揭示，雖然MADS1或FUL2單獨在體外不結合CArG-box基序，但它們的異源復合物表現出特異性DNA結合活性。這些發現確立了FUL2-MADS1模塊作為果實發育程序和血清素代謝通路的關鍵調控因子。

材料與方法概要

本研究使用野生型番茄（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig）進行所有實驗。通過CRISPR/Cas9介導的基因組編輯生成敲除突變體（ful2-cr1、ful2-cr2、rin-cr1、ful1-cr1、tagl1-cr1、mads1-cr1和mads1-cr2）。酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補（BiFC）、分裂熒光素酶互補（Split-LUC）和共免疫沉淀（Co-IP）實驗用于驗證蛋白質相互作用。免疫沉淀-質譜聯用（IP-MS）鑒定FUL2互作蛋白。電泳遷移率變動分析（EMSA）和雙熒光素酶報告基因檢測用于研究DNA結合和轉錄激活。染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）用于全基因組識別FUL2結合位點。通過RNA測序進行轉錄組分析，使用DESeq2進行差異基因表達分析。通過UPLC-ESI-MS/MS進行血清素的絕對定量。

研究意義與應用前景

該研究建立了FUL2-MADS1模塊作為協調果實發育程序與血清素代謝通路的關鍵調控因子。研究發現不僅擴展了MADS-box蛋白在果實結構發育之外的功能范圍，還包括神經活性代謝物的微調。該調控模塊的進化保守性表明其在代謝工程培育營養增強型作物和研究血清素在植物中的生理作用方面具有潛在應用價值。通過精確調控血清素生物合成通路的關鍵節點，為未來作物品質改良和功能性食品開發提供了新的分子靶點和理論依據。