肺上皮細(xì)胞與肺泡巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞通過(guò)直接接觸、TNF-α、ICAM-1和MCP-1協(xié)同調(diào)控細(xì)菌內(nèi)毒素固有免疫應(yīng)答的機(jī)制研究
《Frontiers in Immunology》：Lung epithelial and alveolar macrophage-like cell interactions significantly modify innate responses to bacterial endotoxin with the involvement of direct cellular contacts, TNF-α, ICAM1 and MCP-1
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本研究利用MPI肺泡巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞與MLE-12肺泡上皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型，深入揭示了細(xì)胞間直接接觸、上皮源性的LBP（脂多糖結(jié)合蛋白）以及TNF-α–ICAM-1–MCP-1信號(hào)軸在協(xié)同放大LPS（脂多糖）誘導(dǎo)的肺部固有免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，為理解肺泡免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控及肺部炎癥性疾病機(jī)制提供了新的見解。
引言
肺泡巨噬細(xì)胞（Alveolar Macrophages, AMs）和肺泡上皮細(xì)胞是抵御吸入性病原體的第一道防線。它們之間的相互作用強(qiáng)烈影響著肺部的固有免疫應(yīng)答，然而這種細(xì)胞間通訊的具體機(jī)制尚未被完全闡明。肺泡巨噬細(xì)胞是一類獨(dú)特的組織駐留巨噬細(xì)胞，其分化、存活和功能維持依賴于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF），而非巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Macrophage Colony-Stimulating Factor, M-CSF）。與由骨髓單核細(xì)胞補(bǔ)充的巨噬細(xì)胞不同，肺泡巨噬細(xì)胞起源于胎肝單核細(xì)胞，并在肺內(nèi)自我更新。肺泡上皮細(xì)胞，特別是II型肺泡上皮細(xì)胞，通過(guò)分泌表面活性物質(zhì)等因子，塑造了肺泡腔獨(dú)特的免疫微環(huán)境，并對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的分化和功能具有重要影響。細(xì)胞間粘附分子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1, ICAM-1）作為一種跨膜糖蛋白，已被證實(shí)是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵分子，尤其在LPS刺激的免疫應(yīng)答中。
材料與方法
本研究采用MPI肺泡巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞（一種原代、非轉(zhuǎn)化、持續(xù)增殖且GM-CSF依賴的巨噬細(xì)胞模型，能準(zhǔn)確模擬肺泡巨噬細(xì)胞的特性）與MLE-12小鼠肺泡II型上皮細(xì)胞系建立共培養(yǎng)體系。MPI細(xì)胞在含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）和10 ng/mL GM-CSF的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MLE-12細(xì)胞在含有2% FBS及多種添加物（胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、氫化可的松、β-雌二醇）的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共培養(yǎng)時(shí)，先將MLE-12細(xì)胞接種形成單層，再加入MPI細(xì)胞。使用來(lái)自大腸桿菌O111:B4的100 ng/mL超純LPS刺激細(xì)胞。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、Luminex多因子檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)（包括磷酸化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MAPK通路和NF-κB活化）、熒光激活細(xì)胞分選（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和熒光顯微鏡等技術(shù)分析細(xì)胞因子分泌、表面分子表達(dá)、信號(hào)通路活化和細(xì)胞凋亡等情況。實(shí)驗(yàn)中使用ICAM-1和TNF-α的中和抗體來(lái)探究其功能。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism軟件。
結(jié)果
LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)在MPI/MLE-12共培養(yǎng)中增強(qiáng)
在無(wú)血清條件下，與MPI或MLE-12細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，LPS刺激的共培養(yǎng)體系表現(xiàn)出多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子（包括IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-2、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IL-1α）分泌的顯著增強(qiáng)。單獨(dú)培養(yǎng)的MPI細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)較弱。共培養(yǎng)體系中IL-6的產(chǎn)生呈LPS劑量和時(shí)間依賴性，并且與共培養(yǎng)中MPI細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)。
MLE-12細(xì)胞產(chǎn)生LBP
研究發(fā)現(xiàn)，MLE-12細(xì)胞是脂多糖結(jié)合蛋白（Lipopolysaccharide Binding Protein, LBP）的來(lái)源，其在共培養(yǎng)條件下也能分泌LBP。LBP對(duì)于MPI細(xì)胞通過(guò)TLR4識(shí)別LPS至關(guān)重要，這解釋了在無(wú)血清條件下共培養(yǎng)體系對(duì)LPS產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)的原因。
非LBP依賴的機(jī)制也促進(jìn)共培養(yǎng)細(xì)胞因子反應(yīng)增強(qiáng)
除了LPS，共培養(yǎng)體系對(duì)TLR2/6激動(dòng)劑FSL-1和蟑螂提取物（另一種TLR2刺激物）的細(xì)胞因子反應(yīng)也顯著增強(qiáng)，這表明除了上皮細(xì)胞來(lái)源的LBP外，還存在LBP非依賴的機(jī)制共同放大了免疫應(yīng)答。
直接細(xì)胞接觸是共培養(yǎng)協(xié)同效應(yīng)所必需的
即使在含有血清（即外源性LBP）的條件下，共培養(yǎng)仍能增強(qiáng)LPS反應(yīng)，但增強(qiáng)幅度小于無(wú)血清條件。短期（3小時(shí)）共培養(yǎng)不足以增強(qiáng)反應(yīng)。使用未刺激或LPS刺激的MLE-12細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)MPI細(xì)胞，均無(wú)法重現(xiàn)共培養(yǎng)的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)，表明直接細(xì)胞間接觸是必需的，可溶性因子 alone 不足以介導(dǎo)此效應(yīng)。
LPS刺激的共培養(yǎng)中MLE-12細(xì)胞ICAM-1表達(dá)上調(diào)
流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在共培養(yǎng)并經(jīng)LPS刺激后，MLE-12細(xì)胞表面的ICAM-1表達(dá)顯著增加，而單獨(dú)培養(yǎng)的MLE-12細(xì)胞即使經(jīng)LPS刺激，ICAM-1表達(dá)也無(wú)明顯變化。MPI細(xì)胞本身具有較高的基礎(chǔ)ICAM-1表達(dá)，LPS刺激后其表達(dá)進(jìn)一步增加。
MPI細(xì)胞分泌的可溶性因子誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞ICAM-1表達(dá)及凋亡
使用經(jīng)LPS刺激并去除LPS的MPI細(xì)胞條件培養(yǎng)基（活化MPI培養(yǎng)基）培養(yǎng)MLE-12細(xì)胞，可誘導(dǎo)其ICAM-1表達(dá)上調(diào)并引發(fā)細(xì)胞凋亡（表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、膜起泡和Caspase-3/7活性增加）。而未刺激的MPI細(xì)胞條件培養(yǎng)基無(wú)此效應(yīng)。
TNF-α是MPI細(xì)胞誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞ICAM-1表達(dá)和凋亡的關(guān)鍵因子
重組TNF-α能以劑量依賴的方式誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞ICAM-1表達(dá)和凋亡。在LPS活化的MPI條件培養(yǎng)基中加入TNF-α阻斷性抗體，則能抑制其對(duì)MLE-12細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的上調(diào)和凋亡的誘導(dǎo)作用，證實(shí)TNF-α的核心作用。
共培養(yǎng)中LPS刺激導(dǎo)致MPI細(xì)胞MAPK和MLE-12細(xì)胞NF-κB活化增強(qiáng)
磷酸化流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在LPS刺激的共培養(yǎng)中，MPI細(xì)胞的MAPK信號(hào)通路（ERK、p38、JNK）活化增強(qiáng)（ERK活化提前，p38和JNK活化延遲），而MLE-12細(xì)胞的NF-κB活化則從早期（1-4小時(shí)）即顯著增強(qiáng)。
活化的MLE-12細(xì)胞可誘導(dǎo)初始MPI細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子
將MLE-12細(xì)胞先用LPS活化的MPI條件培養(yǎng)基處理（制備成炎癥性MLE-12細(xì)胞，MLE-12inflam），再與初始MPI細(xì)胞共培養(yǎng)，即使不額外添加LPS，也能誘導(dǎo)MCP-1、MIP-2和IP-10的分泌顯著增加，但不誘導(dǎo)IL-6和TNF-α。使用ICAM-1阻斷抗體預(yù)處理MLE-12inflam細(xì)胞，可特異性抑制MCP-1的產(chǎn)生，而對(duì)MIP-2和IP-10無(wú)影響，表明MCP-1的產(chǎn)生依賴于ICAM-1。
MLE-12細(xì)胞是LPS刺激共培養(yǎng)中MCP-1的主要細(xì)胞來(lái)源
通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激的共培養(yǎng)中，MLE-12細(xì)胞是MCP-1更主要的產(chǎn)生細(xì)胞，其產(chǎn)生的MCP-1水平高于共培養(yǎng)中的MPI細(xì)胞。
討論
本研究闡明了肺泡上皮細(xì)胞與肺泡巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞之間相互作用協(xié)同放大細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS）固有免疫應(yīng)答的多種機(jī)制。上皮細(xì)胞來(lái)源的LBP為TLR4有效識(shí)別LPS提供了關(guān)鍵條件。此外，LBP非依賴的機(jī)制，特別是直接細(xì)胞接觸，也發(fā)揮著重要作用。研究揭示了一個(gè)由TNF-α–ICAM-1–MCP-1構(gòu)成的信號(hào)軸：LPS激活的MPI細(xì)胞釋放TNF-α，TNF-α誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞表達(dá)ICAM-1并引發(fā)凋亡；上調(diào)的ICAM-1通過(guò)細(xì)胞接觸依賴的方式，進(jìn)而促進(jìn)MLE-12細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1。信號(hào)通路分析顯示共培養(yǎng)特異性地增強(qiáng)了MPI細(xì)胞的MAPK活化和MLE-12細(xì)胞的NF-κB活化。這些發(fā)現(xiàn)揭示了肺泡免疫界面處一個(gè)精密的協(xié)同與放大網(wǎng)絡(luò)，涉及可溶性因子、直接細(xì)胞接觸和表面分子（如ICAM-1）的多重互動(dòng)。該研究建立的MPI–MLE-12共培養(yǎng)模型為剖析肺部固有免疫機(jī)制提供了一個(gè)可操作的研究平臺(tái)，其發(fā)現(xiàn)對(duì)于理解肺炎、急性肺損傷等肺部炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制具有啟示意義。研究的局限性在于使用了細(xì)胞系模型和較強(qiáng)的TLR配體刺激，未來(lái)需要互補(bǔ)的體內(nèi)外模型加以驗(yàn)證和拓展。
