《Frontiers in Genome Editing》：CRISPR/Cas9-based programmable genome editing in chickens: concepts, applications and regulatory issues
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本綜述系統闡述了CRISPR/Cas9技術在雞基因組編輯中的原理與應用前景。文章詳細介紹了該技術如何通過引導RNA（gRNA）與Cas9核酸酶靶向特定DNA序列，誘導雙鏈斷裂（DSB），并通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）機制實現基因敲除（Knock-out）、敲入（Knock-in）及精準調控。其在增強禽流感（AIV）和馬立克氏病（Marek’s disease）抗性、提升生長速率與產蛋性能、實現早期胚胎性別鑒定以解決雄性雛雞淘汰倫理問題、調控繁殖性狀、以及利用雞蛋作為生物反應器（Bioreactor）生產治療性蛋白（如人脂聯素ADPN、干擾素-β hIFN-β）等方面展現出巨大潛力。同時，文章也探討了CRISPR激活（CRISPRa）與CRISPR干擾（CRISPRi）等衍生工具的應用，并分析了相關的倫理與監管挑戰。
引言
隨著人口增長和對食物營養需求的急劇增加，優質畜禽生產面臨著巨大壓力。雞作為最重要的家禽之一，是蛋白質和營養物質最廉價的來源。然而，禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）等疾病的突然爆發給經濟和國家乃至國際層面的寶貴種質資源造成了不可逆轉的損失。目前，尚無有效方法應對此類疾病爆發，活禽仍易受病毒攻擊。在此背景下，雞及其他禽類的基因組編輯技術已成為遺傳研究和農業創新領域的突破性工具。
雞細胞中的可編程基因組編輯
精準基因組工程（Precision Genome Engineering, PGE）工具能夠快速、精確地修改家禽基因組，開啟了家禽靶向育種的新時代。這些工具不僅能導致基因功能喪失，還能通過誘導DNA雙鏈斷裂（Double-Strand Break, DSB）促進同源重組（Homology-Directed Repair, HDR）。目前，已經能夠將種內或種間單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）引入雞品系以增強其生產力。轉基因技術，包括慢病毒載體、piggyBac轉座以及睡美人系統，促進了外源基因表達動物的開發。而CRISPR/Cas9系統的出現使得精確編輯基因組信息變得更為簡便。
成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）：第三代基因組編輯工具
CRISPR及其相關的Cas9蛋白代表了第三代可編程基因組編輯工具。CRISPR和Cas9是原核生物DNA組成部分，在細菌免疫系統中起關鍵作用，幫助消除轉導、接合或轉化的外源DNA。CRISPR/Cas9系統識別并誘導靶DNA序列中的DSB，與鋅指核酸酶（ZFN）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）不同，它不需要成對單元來誘導DSB。其靶向特異性通過gRNA-DNA堿基配對和Cas9對原間隔區相鄰基序（Protospacer Adjacent Motif, PAM）的識別來實現。CRISPR/Cas9通過質粒系統遞送，Cas9和gRNA會瞬時表達并在48-72小時內降解，不留下永久性的遺傳足跡。
CRISPR/Cas9與雞基因組改變：來自體外研究的證據
CRISPR/Cas9基因組編輯技術的出現徹底改變了遺傳工程領域，特別是在雞基因組中實現精確高效的改變。與傳統方法相比，CRISPR/Cas9為禽類（包括作為農業進步和生物醫學研究關鍵模型生物的雞）的靶向誘變提供了一個可編程且強大的平臺。研究顯示，在DF-1細胞中，針對過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、ATP合成酶ε亞基（ATP5E）和卵清蛋白（OVA）基因的編輯效率高達95%。CRISPR變體如Cas9-D10A切口酶、通過同源介導末端連接（HMEJ）的位點特異性整合以及同源重組也在體細胞中取得了高達100%的編輯成功率。除了DF-1細胞，類似的應用也見于原始生殖細胞（Primordial Germ Cells, PGCs）和胚胎干細胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）等其他細胞類型。
具有特殊功能編輯雞的培育
在哺乳動物系統中，胚胎收集和體外操作相對直接，而鳥類中的CRISPR/Cas9基因編輯策略則依賴于PGCs的分離、體外培養和增殖，隨后進行遺傳修飾并注射到發育中的受體胚胎血液中。這一多步驟過程大大限制了基因組編輯雞的產生效率。通過CRISPR介導的PGCs同源重組已成功實現雞的種系基因編輯。例如，通過電穿孔介導的CRISPR/Cas9機制對早期雞胚胎進行功能喪失研究，敲除了神經嵴發育中的關鍵轉錄因子Pax7和Sox10。針對CXCR4基因的移碼突變研究揭示了其在家雞PGCs遷移中的作用。基于腺病毒的CRISPR載體也成功產生了MSTN和黑色素親和素（melanophilin）敲除，以研究鴨和雞中的功能喪失。
CRISPR變體、細胞類型和靶基因決定編輯效率
CRISPR/Cas9基因組編輯的效率在不同雞細胞類型、遞送平臺以及編輯策略之間存在顯著差異。在DF-1成纖維細胞中，突變效率范圍從25%到近100%，而在PGCs中則為0%至100%。DF-1細胞特別適合CRISPR/Cas9誘變，在使用嘌呤霉素富集等選擇方法后，突變率高達95%。PGCs作為種系前體細胞，具有獨特的細胞環境，其染色質可及性、細胞周期時序和先天的DNA損傷反應機制在決定CRISPR干預結果方面起著關鍵作用。將傳統CRISPR/Cas9與D10A切口酶變體和同源重組相結合，可將編輯效率提高到100%。使用替代報告基因或可選擇標記物（如雙報告系統）可以富集成功編輯的細胞，將核酸酶誘導突變的表觀頻率提高至41.9%。抗生素選擇策略是決定雞細胞中基因組編輯事件成功的主要因素。
CRISPR/Cas9介導的基因組編輯在家禽中的應用
基因組編輯技術徹底改變了遺傳學研究，使研究人員能夠以前所未有的精確度解析和操作基因組。在家禽中，CRISPR/Cas9技術已成功應用于多種場景。
CRISPR介導的體細胞操作
CRISPR/Cas9核酸酶已廣泛用于雞體細胞和胚胎細胞。通過使用富集系統，在雞DF-1體細胞和胚胎干細胞中實現了PPAR、ATP5E和OVA基因的有效基因破壞。通過直接電穿孔在早期羊膜胚胎體節中實現PAX7基因的體內破壞也有報道。這些研究顯示了15%至41%不等的敲低效率，主要與轉染方法和細胞系統有關。
僅產生雌性后代
由于雄性蛋雞的肉用生長效率低下，剛孵出的雄性雛雞在孵化后不久即被撲殺，引發了嚴重的倫理和經濟問題。基因編輯通過將標記基因插入Z染色體提供了有前景的解決方案。最近開發的“圣杯”（Holy Grail, HG）系統通過將遺傳構建體插入Z染色體，選擇性阻斷雄性胚胎發育。經過藍光處理的雞蛋僅產生健康的雌性雛雞。該系統確保了100%的雄性消除，與孵化場實踐無縫銜接。
提高雞的生長速率
肌肉生長抑制素（Myostatin, MSTN）是TGF-超家族成員，是骨骼肌發育過程中肌生成的已知負調控因子。MSTN的缺失會導致骨骼肌過度生長。使用CRISPR/Cas9 D10A切口酶變體成功編輯了雞MSTN基因，導致體外MSTN蛋白表達缺失，以及體內雞表現出胸部和腿部肌肉質量增加，同時腹部脂肪沉積減少。
揭示雞蛋過敏的原因
雞蛋過敏是兒童中最常見的食物過敏，影響高達2%的人口。卵類粘蛋白（Ovomucoid, OVM）和卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）是雞蛋中的主要過敏原。通過TALEN誘導PGC突變，成功創造了針對OVA基因的特異性基因敲除雞。通過使用編碼Cas9、單向導RNA（sgRNA）和耐藥性基因的質粒轉染雞PGCs，并經過短暫的抗生素選擇，高效地（>90%）誘變了OVA和OVM基因。移植突變OVM的PGCs到受體雞胚胎中，產生了OVM基因破壞的純合子和雜合子。這些過敏原編碼基因純合突變母雞所產的蛋，對于雞蛋過敏者可能是可耐受的。
雞蛋生化成分的修飾
通過靶向卵巢中極低密度脂蛋白（VLDL）等關鍵調節因子，可以改變雞蛋的脂質含量。前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（Pcsk9）在調節膽固醇水平方面發揮作用，該基因已通過CRISPR/Cas9成功敲除，效果持續6個月。通過同時破壞PGCs中的多個過敏原基因，可以更快地培育出產低過敏性雞蛋的母雞。
培育具有內在疾病抗性的雞
家禽疾病爆發對商業家禽業構成嚴重威脅。基因編輯是禽類疾病抗性最有前景的方法之一。通過精確、靶向破壞tva、tvb和chNHE1受體基因，可以增強對ALV亞型A、B和J的抗性。雞ANP32A（chANP32A）蛋白是AIV聚合酶活性的物種特異性宿主因子。通過基因編輯技術替換chANP32A基因為人源ANP32A（huANP32A）基因，可能降低AIV在雞細胞中的聚合酶活性，賦予鳥類疾病抗性。比較雞和鴨的基因組學也為疾病抗性基因編輯靶點提供了線索。
增強氣候適應力
熱應激等氣候變化顯著影響家禽生產和產品質量。利用CRISPR/Cas9技術精確調控熱休克蛋白（HSP70, HSP90）和甲狀腺激素受體等熱響應基因的表達，可以增強鳥類在熱應激下維持細胞功能的能力。對尼日利亞本土雞的基因組分析已鑒定出包括熱激轉錄因子1（HSF1）和缺氧誘導因子3α（HIF3A）在內的關鍵耐熱性和免疫反應基因。
雞蛋表達的生物制藥與CRISPR/Cas9在禽類生物反應器中的作用
禽類生物反應器已被探索用于在雞蛋中生產特定的重組蛋白。將CRISPR/Cas9基因組編輯系統與具有種系能力的PGCs相結合，允許外源基因在卵巢細胞中靶向整合和表達，并在蛋清中表達，通常在卵清蛋白（OVA）啟動子的控制下，每蛋產量可達0.5-3.4毫克蛋白質。通過敲入（Knock-in, KI）策略，將cDNA構建體通過CRISPR/Cas9系統精確引入PGCs，可以產生種系嵌合公雞，進而培育能產下含目標蛋白雞蛋的轉基因母雞。近期進展包括生產具有胰島素抵抗治療潛力的人脂聯素（ADPN），以及人干擾素-β（hIFN-β）。增強型綠色熒光蛋白（EGFP）和綠色熒光蛋白（GFP）也已被成功生產作為遺傳修飾的視覺標記。
CRISPR激活（CRISPRa）與CRISPR干擾（CRISPRi）
CRISPRa和CRISPRi使用催化失活的Cas9（dCas9）變體，能夠以可控和可逆的方式開啟或關閉基因表達，而無需改變DNA序列。CRISPRa將dCas9與轉錄激活域（如VP64, VPR, p300）融合，刺激基因表達；CRISPRi將dCas9與抑制域（如KRAB）融合，抑制基因表達。近期研究已在雞DF-1成纖維細胞中高效使用了CRISPRa和CRISPRi。gRNA相對于轉錄起始位點（TSS）的位置顯著影響激活和抑制的效率。擴展的CRISPR工具包為開發具有更高生產力、疾病抗性和定制雞蛋成分的動物提供了潛力。
CRISPR/Cas9的倫理問題與監管批準
農場動物基因組編輯的進步伴隨著一系列復雜的倫理和監管挑戰。全球各國對基因組編輯生物體（包括雞）主要采取了兩種監管框架：基于過程的監管體系和基于產品的監管體系。歐盟等地采用基于過程的系統，任何通過基因組編輯技術產生的生物體都受到嚴格的轉基因生物（GMO）法規管轄。美國、阿根廷等地則采用基于產品的系統，監管重點在于最終生物體的特性，如果編輯生物體不含有外源遺傳物質，則可能不被歸類為GMO。安全風險評估、脫靶效應、對動物健康和環境的長期影響以及公眾接受度是監管考慮的關鍵。各國監管環境的差異影響了全球研究合作、商業化戰略和消費者對基因組編輯動物的接受度。
結論
家畜基因組編輯代表了農業科學的一次變革性飛躍，有望顯著提高動物養殖的效率、可持續性和福利。利用CRISPR-Cas9等尖端工具，科學家現在可以對雞等家畜物種進行精確的遺傳修飾，以改善疾病抗性、生長速率、繁殖效率和肉品質等性狀。該技術不僅有望提高生產力并減少畜牧養殖的環境足跡，還為應對糧食安全、食品安全和氣候變化等全球挑戰開辟了新途徑。同時，基因組編輯雞對人類的影響是多方面的。然而，雞的基因組編輯也引發了重要的倫理、監管和社會問題，這將塑造動物育種和農業的未來。
