《Science of Traditional Chinese Medicine》：Complete chloroplast genomes and phylogenetic analysis of 7 Murraya species in China
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本研究通過對中國7種九里香屬（Murraya）植物進(jìn)行葉綠體（CP）全基因組測序和比較基因組學(xué)分析，揭示了該屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因組特征及適應(yīng)性進(jìn)化。研究確定了可用于物種鑒定的高變區(qū)（如ycf1基因），證實(shí)了外來九里香（M. exotica）和千里香（M. paniculata）為獨(dú)立物種，并發(fā)現(xiàn)九里香屬并非單系群。該研究為蕓香科植物分類、DNA標(biāo)記開發(fā)和進(jìn)化歷史研究提供了重要的基因組學(xué)數(shù)據(jù)。
背景與目的
九里香屬（Murraya）是蕓香科（Rutaceae）灌木和喬木植物，在中國約有9個物種，具有重要的藥用和園藝價值。然而，該屬的系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)存在爭議，尤其是外來九里香（Murraya exotica）和千里香（Murraya paniculata）的分類地位。本研究旨在通過對7種九里香屬植物的葉綠體（CP）全基因組進(jìn)行測序、組裝和比較分析，為解決其分類、系統(tǒng)發(fā)育和物種鑒定問題提供新的見解。
材料與方法
研究收集了32份樣品，代表7種九里香屬植物，并從GenBank獲取了6種蕓香科植物的CP基因組數(shù)據(jù)。利用Illumina NovaSeq 6000平臺進(jìn)行測序，使用GetOrganelle軟件進(jìn)行基因組組裝，通過PGA和GeSeq進(jìn)行注釋。利用REPuter和MISA分別分析長重復(fù)序列和簡單序列重復(fù)（SSR）。通過IRscope、mVISTA和MAUVE進(jìn)行基因組比較和分歧分析。使用EasyCodeML進(jìn)行陽性選擇分析，基于最大似然法（ML）和貝葉斯推斷（BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過MCMCtree估算分化時間。
結(jié)果
基因組特征
九里香屬植物的CP基因組長度在158,573至160,817 bp之間，呈現(xiàn)典型的四分體結(jié)構(gòu)，包括大單拷貝區(qū)（LSC）、小單拷貝區(qū)（SSC）和兩個反向重復(fù)區(qū)（IR）。基因組共編碼112個獨(dú)特基因，包括78個蛋白編碼基因、30個tRNA基因和4個rRNA基因。IR區(qū)的序列分歧低于單拷貝區(qū)，編碼區(qū)比非編碼區(qū)更保守。ndhD基因在部分樣品中因缺少有效起始密碼子而被注釋為假基因。
重復(fù)序列分析
共鑒定到1233個長重復(fù)序列，包括正向、反向、互補(bǔ)和回文重復(fù)，其中回文重復(fù)最為豐富。檢測到7924個SSR，以A/T單核苷酸重復(fù)為主。重復(fù)序列的數(shù)量和分布在物種間存在一定差異。
比較基因組學(xué)與IR區(qū)邊界
IR區(qū)的收縮和擴(kuò)張是影響基因組大小的主要因素。M. kwangsiensis var. macrophylla的IR區(qū)發(fā)生收縮，導(dǎo)致rps19基因的一個拷貝丟失。比較分析發(fā)現(xiàn)多個高變區(qū)，如matK、ycf1、ndhI–ndhA、trnH-GUG-psbA和rpl32–trnL，其中ycf1基因被驗(yàn)證可用于區(qū)分M. exotica和M. paniculata。
陽性選擇分析
在78個共享蛋白編碼基因中，檢測到10個基因受到陽性選擇，包括rbcL、psaJ、ndhD、ndhF、rpl2、rpl20、ycf1、accD、ccsA和rpl32。這些基因主要參與光合作用、蛋白質(zhì)導(dǎo)入和核糖體組裝等過程。
系統(tǒng)發(fā)育與分化時間
系統(tǒng)發(fā)育分析支持將九里香屬劃分為兩個主要類群：Sect. Murraya（包括M. exotica、M. paniculata和M. alata）和Sect. Bergera（包括M. euchrestifolia、M. kwangsiensis等）。九里香屬并非單系群，Sect. Bergera與Clausena親緣關(guān)系更近。分化時間估算顯示，Sect. Murraya物種的分化發(fā)生在約9.11 Mya（95% HPD: 4.90–13.87 Mya），M. exotica和M. alata的分化時間約為5.85 Mya。
分子標(biāo)記開發(fā)
基于ycf1基因設(shè)計(jì)特異性引物，成功開發(fā)出可區(qū)分M. exotica和M. paniculata的分子標(biāo)記。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為450 bp，通過SNP分析可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確物種鑒定。
討論
九里香屬CP基因組在結(jié)構(gòu)和基因組成上高度保守，但I(xiàn)R區(qū)的收縮擴(kuò)張及高變區(qū)的存在為物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究提供了重要信息。陽性選擇基因可能與其對高光環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果支持將Sect. Murraya和Sect. Bergera提升為屬級分類單元，并確認(rèn)M. exotica和M. paniculata為獨(dú)立物種。研究開發(fā)的ycf1分子標(biāo)記為藥材基原鑒定和資源保護(hù)提供了有效工具。
結(jié)論
本研究首次報(bào)道了5種九里香屬植物的CP全基因組，揭示了其基因組特征、重復(fù)序列分布和進(jìn)化動態(tài)。研究結(jié)果為九里香屬的分類修訂、物種鑒定和進(jìn)化歷史提供了堅(jiān)實(shí)的基因組學(xué)證據(jù)，對促進(jìn)該屬植物的藥用資源開發(fā)和保護(hù)具有重要意義。
