季節(jié)性流感A（H3N2）病毒因其快速進(jìn)化導(dǎo)致的抗原漂移，使得疫苗有效性常因抗原不匹配而受限。準(zhǔn)確表征流行病毒的抗原特性對(duì)于疫苗株選擇至關(guān)重要，然而常規(guī)的抗原表征依賴于在細(xì)胞系（如MDCK細(xì)胞）或雞胚中分離和擴(kuò)增病毒，此過程可能引入適應(yīng)性突變，改變抗原表位，從而無法真實(shí)反映人群中循環(huán)病毒的特性。本研究旨在探究宿主內(nèi)遺傳多態(tài)性如何影響臨床樣本的抗原特性，以及MDCK細(xì)胞培養(yǎng)如何改變這些模式。

研究分析了2017-2018年流感季節(jié)期間收集的60份甲型H3N2陽性鼻咽拭子樣本。病毒分離嘗試在兩種MDCK衍生細(xì)胞系（MDCK-SIAT1和人源化MDCK細(xì)胞，hCK）中進(jìn)行。結(jié)果顯示，hCK細(xì)胞的病毒分離成功率（90%）顯著高于MDCK-SIAT1細(xì)胞（37.5%）。因此，后續(xù)的基因組和抗原分析均聚焦于hCK來源的分離株。最終，成功獲得45對(duì)匹配的臨床樣本-分離株對(duì)用于下游分析。

對(duì)57個(gè)臨床樣本基因組進(jìn)行HA基因分析顯示，病毒聚類為五個(gè)進(jìn)化枝：3C.2a、3C.2a1、3C.2a2、3C.2a3和3C.2a4，其中3C.2a1（56.1%）和3C.2a2（22.8%）最為流行。值得注意的是，大多數(shù)循環(huán)病毒在遺傳上不同于該季節(jié)使用的疫苗株A/Hong Kong/4801/2014（屬于3C.2a進(jìn)化枝）。所有病毒分離株均與其配對(duì)的臨床樣本緊密聚類，表明病毒分離過程大體上保留了整體的遺傳組成。然而，相對(duì)于疫苗株HK/14的差異主要集中在抗體結(jié)合位點(diǎn)，尤其是3C.2a2進(jìn)化枝顯示出最高的變異度。

通過比較臨床樣本及其配對(duì)分離株的深度測(cè)序數(shù)據(jù)，評(píng)估了病毒分離對(duì)遺傳多樣性的影響。熵分析揭示，臨床樣本中存在顯著的宿主內(nèi)多樣性，尤其在HA和NA基因中，而內(nèi)部基因（如聚合酶復(fù)合體）變異性有限。在HA基因中，臨床樣本的多樣性高于分離株，特別是在五個(gè)主要抗體結(jié)合位點(diǎn)、HA1受體結(jié)合域和HA2莖桿域。大多數(shù)多態(tài)性HA殘基位于表面暴露區(qū)域，位于或接近經(jīng)典抗體結(jié)合位點(diǎn)（如位點(diǎn)B的160位點(diǎn)，位點(diǎn)C的273、308、310位點(diǎn)等）。病毒分離過程施加了快速的純化選擇，顯著降低了宿主內(nèi)遺傳多樣性。例如，在臨床樣本36-NPS中，HA 160位點(diǎn)存在K（35%）、I（27%）和T（21%）三種變異體的混合，而傳代后的分離株中T變異體占主導(dǎo)（92%），熵值從1.56降至0.38。這些發(fā)現(xiàn)表明，臨床樣本以異質(zhì)性的病毒準(zhǔn)種形式存在，而細(xì)胞培養(yǎng)分離通過選擇性富集適應(yīng)性變異體，減少或排除了代表體內(nèi)病毒多樣性的變異體。

為了評(píng)估MDCK細(xì)胞分離過程中宿主內(nèi)多態(tài)性的變化是否改變抗原特性，研究對(duì)24個(gè)病毒分離株進(jìn)行了常規(guī)血凝抑制（HAI） assay分析，并對(duì)代表五個(gè)遺傳進(jìn)化枝的16對(duì)臨床樣本-分離株對(duì)進(jìn)行了高靈敏度的polyPLA分析。HAI抗原圖譜顯示，大多數(shù)分離株與其相應(yīng)的遺傳進(jìn)化枝參考株抗原性接近。相比之下，基于polyPLA的抗原圖譜揭示了更大的異質(zhì)性，臨床樣本顯示出更廣泛的抗原變異譜。在16對(duì)測(cè)試的配對(duì)中，僅5對(duì)顯示出小于2個(gè)單位的抗原距離（每個(gè)單位代表polyPLA滴度的兩倍變化），其余配對(duì)的抗原距離范圍在2.1至7.1個(gè)單位之間，表明存在明顯的抗原特性差異。分子分析表明，這些抗原差異主要與HA和NA的序列變異相關(guān)。例如，臨床樣本36-NPS與其配對(duì)分離株36-hCK之間存在1.6個(gè)單位的抗原距離；臨床樣本在抗體結(jié)合位點(diǎn)B的HA 160位點(diǎn)存在K/I/T混合群體，而分離株36-hCK中則以160T為主。這些發(fā)現(xiàn)證明，MDCK細(xì)胞中的病毒分離改變了遺傳多樣性臨床群體中的變異體組成，減少了宿主內(nèi)多樣性，并導(dǎo)致了可測(cè)量的抗原變化。

研究假設(shè)臨床樣本中的宿主內(nèi)多態(tài)性產(chǎn)生了一個(gè)共識(shí)序列無法捕獲的抗原表型連續(xù)體。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究聚焦于HA蛋白160位點(diǎn)（位于抗體結(jié)合位點(diǎn)B），該位點(diǎn)在數(shù)據(jù)集中顯示出最高的熵值。利用反向遺傳學(xué)（PR8 + 2系統(tǒng)），研究人員構(gòu)建了三種重組病毒，分別攜帶該位點(diǎn)自然發(fā)生的一種變異體（HA:160K, HA:160T, 或 HA:160I）。為了模擬臨床樣本中觀察到的準(zhǔn)種組成，創(chuàng)建了11個(gè)病毒群體：三個(gè)純變異體和八個(gè)特定比例的混合物，包括一個(gè)復(fù)制臨床樣本36-NPS組成（rg160K:rg160T:rg160I; 35:27:21）的混合物。抗原譜分析（使用微量中和MN和polyPLA assay）顯示，HA 160位點(diǎn)的變異使抗原表型改變了約1-2個(gè)單位。純變異體在抗原空間中占據(jù)不同的位置，而混合群體則根據(jù)主導(dǎo)殘基顯示出中間或偏移的位置。然而，它們的抗原特性并不遵循簡(jiǎn)單的比例平均。例如，富含rgT160的混合物（10:80:10）和（50:25:25）聚集在rgT160（0:100:0）病毒附近，抗原距離分別僅增加0.18和0.56個(gè)單位。詳細(xì)的MN滴度證實(shí)了160位點(diǎn)多態(tài)性的非加性抗原效應(yīng)。混合群體產(chǎn)生了一個(gè)連續(xù)的滴度范圍（1:160–1:640），該范圍并不隨變異體組成線性縮放。這些發(fā)現(xiàn)表明，HA 160位點(diǎn)的多態(tài)性以非加性方式重塑抗原識(shí)別，混合準(zhǔn)種表現(xiàn)出不同于克隆病毒的新興抗原譜，強(qiáng)調(diào)了宿主內(nèi)多樣性如何促進(jìn)流感抗原復(fù)雜性。

本研究直接證明了臨床甲型H3N2樣本中的宿主內(nèi)多態(tài)性導(dǎo)致可測(cè)量的抗原多樣性，而MDCK細(xì)胞中的病毒繁殖施加了強(qiáng)純化選擇，改變了遺傳和抗原特性。通過結(jié)合深度測(cè)序和血清學(xué)分析（包括高靈敏度polyPLA），研究表明臨床樣本存在顯著的宿主內(nèi)變異，特別是在表面暴露的HA殘基上。MDCK細(xì)胞中的病毒分離通過選擇性富集適應(yīng)性變異體顯著降低了這種多樣性，并且關(guān)鍵位點(diǎn)（如HA:160）的多態(tài)性產(chǎn)生了無法僅從共識(shí)序列預(yù)測(cè)的非線性抗原結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)揭示了當(dāng)前全球流感監(jiān)測(cè)和應(yīng)對(duì)系統(tǒng)（GISRS）工作流程中一個(gè)關(guān)鍵的偏差來源，該流程主要依賴傳代分離株進(jìn)行抗原表征。培養(yǎng)誘導(dǎo)的選擇性富集特定HA變異體，并模糊了體內(nèi)存在的更廣泛的抗原景觀。研究結(jié)果支持采用直接從未培養(yǎng)臨床材料評(píng)估抗原性的方法，以更準(zhǔn)確地捕捉人類感染中循環(huán)的多樣性。此外，準(zhǔn)種混合物的實(shí)驗(yàn)重建表明，單個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性可以產(chǎn)生非線性的抗原效應(yīng)，這可能是由于HA三聚體內(nèi)單體共組裝或糖基化改變導(dǎo)致的表位相互作用。PolyPLA被證明是直接評(píng)估臨床材料抗原關(guān)系的強(qiáng)大工具，比常規(guī)HAI或MN assay能捕獲更廣泛的抗體-抗原相互作用。總之，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了將病毒作為動(dòng)態(tài)、異質(zhì)性群體進(jìn)行表征的重要性，以及培養(yǎng)適應(yīng)性如何扭曲用于指導(dǎo)疫苗株選擇的抗原數(shù)據(jù)。直接整合血清學(xué)、基因組和結(jié)構(gòu)分析來表征臨床樣本中的病毒，將為循環(huán)病毒的抗原景觀提供更真實(shí)的表征，這對(duì)于提高流感疫苗株選擇的精確性至關(guān)重要。

臨床樣本：鼻咽拭子樣本來自2017-2018年流感季節(jié)，由密西西比州公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室通過全州范圍的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)收集。樣本基于甲型H3N2 qRT-PCR陽性且剩余體積足夠進(jìn)行病毒分離和全基因組測(cè)序而選擇。

細(xì)胞：使用了三種MDCK衍生細(xì)胞系：人源化MDCK細(xì)胞（hCK）、MDCK-SIAT1細(xì)胞和MDCK-CCL34細(xì)胞。

病毒和雪貂血清：使用了四個(gè)參考病毒株：A/Hong Kong/4801/2014 (H3N2) (HK/14), A/Singapore/IFNIMH-16-0019/2016 (SGP/16), A/Kansas/14/2017 (KS/17), 和 A/New Mexico/14/2018 (NM/18)。雪貂血清通過鼻內(nèi)感染雪貂并收集感染后四周的血清制備。

病毒分離：按照WHO指南將臨床樣本接種到hCK和MDCK-SIAT1細(xì)胞中進(jìn)行病毒分離。

核酸提取：使用MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit從鼻咽拭子樣本中提取病毒RNA。

定量RT-PCR：使用針對(duì)甲型流感病毒M基因的引物和探針進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

反向遺傳學(xué)產(chǎn)生重組病毒：使用八質(zhì)粒系統(tǒng)，將來自臨床樣本36-NPS的HA和NA基因（在160位點(diǎn)構(gòu)建K、T、I三種變異體）與A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)的六個(gè)內(nèi)部基因片段組合，拯救出6:2重配病毒。

HA和HAI assay：使用0.75%豚鼠紅細(xì)胞按照WHO標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。

polyPLA assay：如前所述進(jìn)行。簡(jiǎn)要來說，將針對(duì)參考株的多克隆雪貂血清和NP特異性單克隆抗體進(jìn)行生物素化并制備成鄰近探針。病毒樣本與探針混合物孵育過夜后，進(jìn)行連接、蛋白酶處理和定量PCR檢測(cè)。

MN assay：按照WHO方案進(jìn)行。將系列稀釋的血清與100 TCID₅₀的病毒混合孵育后，加入hCK細(xì)胞，18-20小時(shí)后通過ELISA檢測(cè)病毒復(fù)制抑制情況。

新一代測(cè)序（NGS）和數(shù)據(jù)分析：使用甲型流感通用引物通過兩步RT-PCR擴(kuò)增全基因組。使用Illumina Nextera DNA Flex Library Prep Kit制備文庫，在NextSeq 500/550系統(tǒng)上測(cè)序。使用IRMA（cdc iterative refinement meta-assembler）流感模塊進(jìn)行 reads 處理、組裝和共識(shí)序列生成。使用DiversiTools分析宿主內(nèi)單核苷酸變異（iSNV）和氨基酸多態(tài)性。

遺傳多樣性：通過多序列比對(duì)識(shí)別核苷酸和氨基酸替換。使用DiversiTools計(jì)算每個(gè)氨基酸位點(diǎn)的比例豐度。

香農(nóng)熵：基于可變位點(diǎn)的等位基因頻率計(jì)算香農(nóng)熵，以量化遺傳多樣性。

系統(tǒng)發(fā)育分析：使用BEAST v1.10.5對(duì)所有八個(gè)基因片段進(jìn)行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育推斷，構(gòu)建最大置信度（MCC）樹。

抗原圖譜：使用基于網(wǎng)絡(luò)的抗原圖譜工具（http://sysbio.missouri.edu/AntigenMap），根據(jù)HAI、MN或polyPLA滴度數(shù)據(jù)構(gòu)建抗原圖譜。

結(jié)構(gòu)可視化：使用PyMOL以晶體結(jié)構(gòu)4WE8為模板進(jìn)行可視化。

統(tǒng)計(jì)分析：使用DiversiTools pipeline進(jìn)行多態(tài)性分析。使用R語言ggtree包生成和可視化系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Python自定義腳本創(chuàng)建多態(tài)性和熵圖。