中性粒細胞是急性艱難梭菌感染（CDI）免疫應答中的主導細胞。浸潤結腸的中性粒細胞數量與組織損傷程度和嚴重CDI明確相關，但其加劇組織損傷的機制尚不清楚。本研究探討了表達嗅覺介素4（OLFM4）的中性粒細胞亞群（OLFM4⁺中性粒細胞）在CDI中的作用。單細胞轉錄組學顯示，感染小鼠血液中性粒細胞中Olfm4表達上調，且這些細胞表現出以脫顆粒基因高表達為特征的基因簽名。在感染小鼠中，OLFM4⁺中性粒細胞聚集于腸上皮細胞（IEC）損傷嚴重區域，且感染小鼠和患者血漿OLFM4水平顯著升高。體外實驗中，OLFM4⁺中性粒細胞和重組OLFM4蛋白加劇了艱難梭菌毒素誘導的IEC損傷。本研究為中性粒細胞介導的病理機制提供了新見解，并突出了OLFM4⁺中性粒細胞在惡化CDI誘導的IEC損傷中的作用。

艱難梭菌感染（CDI）是美國最常見的醫療相關感染。研究顯示，急性CDI期間外周血和結腸中性粒細胞數量增加與腹瀉延長和更嚴重的臨床疾病相關。盡管中性粒細胞異質性在其他感染和非感染性炎癥條件下已有研究，但CDI中的中性粒細胞異質性尚未被探索。中性粒細胞在感染后迅速遷移至病灶，其激活觸發脫顆粒和胞質內顆粒預存蛋白的釋放。這些效應物雖主要靶向病原體，但可能對宿主組織產生脫靶損傷。中性粒細胞增多是CDI的標志且與更嚴重疾病相關，因此我們假設中性粒細胞和/或中性粒細胞衍生分子通過促進組織損傷惡化CDI。

嗅覺介素4（OLFM4）是嗅覺介素結構域蛋白家族成員，最初被鑒定為髓系發育中粒細胞集落刺激因子誘導的基因。OLFM4在多組織中表達，包括前列腺、骨骼、乳腺和胃腸道（GI），參與細胞增殖、黏附、凋亡和調節先天免疫反應。在骨髓（BM）和血液中，中性粒細胞是主要的Olfm4表達細胞類型：在BM中，Olfm4在所有粒細胞前體表達，而在外周血中，OLFM4存在于部分中性粒細胞的特定顆粒中。OLFM4在胃腸道疾病中起重要作用。在炎癥性腸病患者中，OLFM4分泌到活動性炎癥區域，而在小鼠中，OLFM4缺失（OLFM4^?/?）導致幽門螺桿菌感染和葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎中細胞因子/趨化因子產生增加、炎癥細胞浸潤和更差結局。

為深入理解OLFM4如何影響CDI，我們檢測了OLFM4⁺中性粒細胞和重組OLFM4蛋白在CDI中的作用。我們發現CDI后中性粒細胞是主要的OLFM4表達細胞。利用單細胞轉錄組學，我們發現表達Olfm4的中性粒細胞具有與中性粒細胞脫顆粒相關的基因特征，且這些中性粒細胞中僅有一個基因與Olfm4共調控。支持轉錄組學數據，我們發現CDI小鼠和患者循環OLFM4水平較對照升高。體外實驗中，小鼠OLFM4⁺中性粒細胞和重組人OLFM4（rhOLFM4）加劇了艱難梭菌毒素誘導的腸上皮細胞（IEC）損傷。我們的發現為CDI中中性粒細胞介導的病理提供了新見解，并突出了OLFM4⁺中性粒細胞在CDI誘導的IEC損傷中的致病作用。

盡管中性粒細胞是小鼠和人類BM和血液中主要的Olfm4表達細胞類型，但在胃腸道中，Olfm4在兩種物種的小腸隱窩和人類結腸上皮中被檢測到。為定義CDI后產生OLFM4的細胞，我們通過流式細胞術評估了感染后第1天未感染和感染野生型（WT）小鼠BM、血液和結腸中OLFM4⁺細胞比例。在未感染和感染小鼠中，OLFM4⁺細胞在BM、血液和固有層（LP）三個組織區室中持續約占中性粒細胞的8%–10%，而非中性粒細胞分數中的OLFM4⁺細胞低于2%。CDI不影響BM和血液中OLFM4⁺中性粒細胞百分比，但其在LP中的比例下降。雖然CDI不影響BM中OLFM4⁺中性粒細胞數量，但血液中其數量有增加趨勢，且CDI后LP中其絕對數量顯著增加。這種不一致——LP中OLFM4⁺中性粒細胞數量增加但比例未增加——表明其積累不是選擇性招募的結果，而是反映了發炎結腸中中性粒細胞區室的整體擴張。

OLFM4是中性粒細胞特定顆粒的組成成分，在有害刺激下釋放。這種釋放可能導致OLFM4⁺中性粒細胞比例減少和每個細胞OLFM4含量降低，如平均熒光強度（MFI）所測量。與此一致，我們觀察到CDI后LP中OLFM4⁺中性粒細胞百分比和其MFI均下降。這些數據提供了令人信服的證據，表明中性粒細胞是CDI后小鼠BM、血液和結腸中OLFM4的重要來源，并提示CDI誘導其從中性粒細胞細胞外釋放的情景。

我們生成了WT C57BL/6小鼠（未感染和急性CDI期間）BM、血液和結腸中性粒細胞的單細胞轉錄組學圖譜。此處，我們利用該單細胞RNA測序（scRNAseq）數據集對表達和不表達Olfm4的中性粒細胞進行深入分析。使用基于熱擴散勢的軌跡嵌入（PHATE）分析可視化不同發育階段的BM和血液中性粒細胞群體。Olfm4在BM中的前中性粒細胞、未成熟中性粒細胞和成熟中性粒細胞以及血液中的成熟中性粒細胞中表達，在BM未成熟和成熟中性粒細胞中檢測到最高表達。CDI不改變BM中性粒細胞Olfm4轉錄水平；然而，在循環中性粒細胞中，感染小鼠細胞Olfm4表達增加。批量RNA-seq研究比較艱難梭菌感染患者與健康對照時，也報告了循環白細胞中OLFM4轉錄本的類似增加。盡管有這種轉錄上調，但血液中OLFM4⁺中性粒細胞比例或其MFI在CDI后未改變，提示轉錄后機制參與調節OLFM4蛋白表達。

在穩態下，LP中中性粒細胞極少。因此，我們無法獲得足夠細胞對未感染小鼠結腸中性粒細胞進行單細胞轉錄組學。然而，對感染小鼠BM、血液和結腸中性粒細胞群體的PHATE分析顯示：（i）LP中性粒細胞處于發育軌跡的末端；（ii）雖然LP中性粒細胞Olfm4表達強度與BM成熟和血液中性粒細胞相似，但與BM成熟和外周血中性粒細胞相比，LP中表達Olfm4的中性粒細胞總數較少。

為表征表達或不表達Olfm4的中性粒細胞之間的轉錄差異，我們對BM、血液和LP中性粒細胞（感染宿主）的scRNAseq數據進行了基因集富集分析（GSEA）。與不表達Olfm4的中性粒細胞相比，表達Olfm4的中性粒細胞顯示與脫顆粒和先天免疫系統相關的基因上調約8至10倍，而與Clec7炎癥小體通路和IL-1加工相關的基因在不表達Olfm4的細胞中增加約七倍。進一步調查后，我們發現表達Olfm4的中性粒細胞中中性粒細胞脫顆粒通路的富集是由Cd177、Ngp和Mmp8表達升高驅動。盡管中性粒細胞脫顆�；�因的峰值表達發生在未成熟中性粒細胞中，但表達與不表達Olfm4的中性粒細胞之間的比較顯示，脫顆�；�因簽名在表達Olfm4組的未成熟和成熟BM及PB中性粒細胞中顯著上調。

CCAAT增強子結合蛋白ε和β（CEBPε和CEBPβ）是中性粒細胞發育各階段中起關鍵作用的轉錄因子：CEBPε參與粒細胞生成的早期階段，而CEBPβ是晚期髓系分化的調節因子。BM、血液和LP表達Olfm4的中性粒細胞共同表達顯著更高的Cebpe，但較不表達Olfm4的細胞表達更少的Cebpb轉錄本。這些數據提示表達Olfm4的中性粒細胞可能更不成熟。因此，我們使用表征未成熟中性粒細胞的基因簽名分數比較這些群體的scRNAseq數據。確實，表達Olfm4的中性粒細胞具有顯著更高的未成熟中性粒細胞基因簽名分數，較不表達Olfm4的中性粒細胞。然而，當按成熟狀態/組織區室分層基因表達時，明顯這種上調主要局限于BM的成熟表達Olfm4中性粒細胞，與不表達Olfm4的中性粒細胞相比。在成熟表達Olfm4中性粒細胞中導致更高未成熟基因簽名分數的關鍵基因包括先前報道在前中性粒細胞和未成熟中性粒細胞階段表達的基因（即Anxa3、Dstn、Cd177和Anxa1）。

差異表達測試揭示了另一個非常有趣的特征。表達Olfm4的細胞具有幾種編碼顆粒和細胞質蛋白的基因（即Cd177、Ngp、S100a8和S100a9）的更高轉錄水平。它們還顯示參與抗菌肽合成（即Camp）、調節細胞間黏附和分化（即Ifitm6）和代謝通路（即Adpgk和Tkt）的基因表達增加。然而，與不表達Olfm4的中性粒細胞相比，最大差異僅在于兩個基因，兩者在表達Olfm4中均>5 log倍增加且為該亞群獨有。這些基因是Olfm4（預期）和一個家鼠（Mus musculus）中的基因，稱為Gm6999。值得注意的是，Gm6999編碼一個長鏈非編碼RNA（lncRNA），其基因組位置與Olfm4在同一染色體上，位于小鼠Olfm4基因座5′區域重疊的位點。盡管Gm6999功能尚未完全表征，但lncRNA在染色質重塑和表觀遺傳調控中起重要作用，值得進一步研究。這些數據揭示了表達與不表達Olfm4的中性粒細胞之間的轉錄差異，包括與脫顆粒和未成熟相關的簽名。

除轉錄組學外，中性粒細胞表面蛋白已被用于表征不同亞群。因此，為進一步表征OLFM4⁺和OLFM4^?中性粒細胞，我們用熒光標記抗體對CD11b、CD177、CXCR2和CXCR4染色并進行流式細胞術。選擇這些標志物是因為它們提供中性粒細胞激活、運輸和定位的功能見解。具體而言，CD11b和CD177與中性粒細胞激活和脫顆粒相關，而CXCR2和CXCR4調節中性粒細胞在BM、循環和發炎組織之間的遷移。評估這些標志物的表達使我們能夠確定OLFM4表達是否識別具有不同激活狀態或遷移潛力的中性粒細胞亞群。在未感染小鼠中，OLFM4⁺和OLFM4^?中性粒細胞之間CD11b、CD177、CXCR2或CXCR4的MFI無差異。在急性CDI期間，雖然所有三個組織中OLFM4⁺和OLFM4^?中性粒細胞上的CD11b、CD177和CXCR2 MFI相似，但CXCR4 MFI不同。在BM中，OLFM4⁺中性粒細胞具有較低的CXCR4，但在LP中，這些細胞具有較高的CXCR4，與相應組織中的OLFM4^?中性粒細胞相比。已發表研究顯示，降低的CXCR4驅動BM中性粒細胞動員入血流，而在組織部位，CXCR4是老化中性粒細胞的標志物，可促進組織損傷。因此，我們的數據指向一種情景，即急性CDI增加OLFM4⁺中性粒細胞從BM的動員，且在LP中，這些細胞表現出高炎癥表型。

血液中高比例的OLFM4⁺中性粒細胞與嚴重終末器官損傷和更差結局相關。因此，我們測試了中性粒細胞OLFM4表達對艱難梭菌相關上皮損傷的直接效應。從WT和年齡匹配的OLFM4^?/?小鼠分選BM中性粒細胞以獲得高純度群體（>95%純度）。然后將中性粒細胞與小鼠上皮細胞系（CMT-93細胞）在有或無艱難梭菌毒素和脂多糖（LPS）的情況下在跨上皮電阻（TEER）測定板中培養。正如預期，艱難梭菌毒素導致IEC屏障損傷，如TEER降低所見。單獨LPS或LPS與中性粒細胞添加不利影響IEC屏障。然而，在艱難梭菌毒素與LPS和中性粒細胞組合中，毒素誘導的TEER下降在WT中性粒細胞存在下進一步加劇，但當使用OLFM4^?/?中性粒細胞時未觀察到。我們的結果與顯示OLFM4⁺中性粒細胞數量與終末器官損傷相關的研究一致，并支持OLFM4⁺中性粒細胞通過不利影響IEC屏障完整性的疾病增強作用（至少在體外）。

我們的流式細胞術數據顯示，除結腸組織外，幼稚和艱難梭菌感染小鼠中OLFM4⁺中性粒細胞百分比在所有區室中相似，在結腸組織中，與未感染對照相比，艱難梭菌感染小鼠中比例降低。已知激活的中性粒細胞作為中性粒細胞胞外陷阱（NETs）的一部分釋放OLFM4。我們的轉錄組學分析顯示表達Olfm4的中性粒細胞上調與脫顆粒相關的基因。因此，我們假設OLFM4在炎癥或組織損傷部位從中性粒細胞釋放，降低細胞內OLFM4，從而降低組織中檢測到的OLFM4⁺中性粒細胞比例。

結腸組織的免疫組織化學顯示，急性CDI期間OLFM4⁺細胞分布在整個黏膜下層，在結腸損傷嚴重區域染色更強烈，與損傷較輕區域相比。上皮損傷評分高（評分>2.5，范圍0–4）的小鼠每個高倍視野OLFM4⁺細胞數多于損傷較輕者。此外，表明OLFM4蛋白可能從激活的結腸中性粒細胞釋放，艱難梭菌感染小鼠在疾病急性期顯示較未感染對照更高的血清OLFM4水平，且這些水平與循環中性粒細胞計數相關。值得注意的是，與假攻擊小鼠相比，艱難梭菌感染小鼠結腸中性粒細胞中細胞內OLFM4的MFI降低。這些發現共同提示OLFM4⁺中性粒細胞在CDI期間為脫顆粒做好準備，導致OLFM4在炎癥部位細胞外釋放。

我們接下來量化了急性CDI患者血清OLFM4濃度，并將其與艱難梭菌檢測陰性的腹瀉個體比較。與我們的鼠模型相似，CDI患者系統性OLFM4水平顯著高于對照，且這些水平與循環WBC計數相關。先前研究顯示，OLFM4⁺中性粒細胞比例和循環OLFM4蛋白量與多種感染中更差結局相關，包括病毒（登革熱、流感和RSV）、細菌（幽門螺桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）和寄生蟲（瘧疾）感染。在膿毒癥中，高百分比OLFM4⁺中性粒細胞見于有嚴重終末器官損傷者。雖然OLFM4⁺和OLFM4^?中性粒細胞表現出相似的激活和吞噬能力，但它們在NET形成傾向上不同。據報道，OLFM4從中性粒細胞釋放可由脫顆粒通路刺激誘導，也可通過NETosis進行。雖然脫顆粒后OLFM4釋放需要強促分泌素，但OLFM4更易作為NET組分釋放。

為確定OLFM4蛋白在CDI發病機制中的作用，我們在IECs上使用重組人OLFM4（rhOLFM4）：將人上皮細胞（Caco2細胞）與rhOLFM4在有和無艱難梭菌毒素的情況下孵育，并如上所述測量TEER。正如預期，艱難梭菌毒素導致IEC屏障損傷，TEER較單獨培養基對照顯著降低。單獨rhOLFM4蛋白（即使在高濃度50 μg/mL）不影響IEC屏障完整性。然而，當與毒素共同給藥相同濃度時，rhOLFM4顯著加劇屏障破壞。這種rhOLFM4的附加效應在較低濃度（5 μg/mL rhOLFM4）未觀察到。

我們研究最重要的發現是：（i）CDI增強外周血中性粒細胞中的Olfm4；（ii）表達Olfm4的中性粒細胞富含脫顆粒相關基因簽名；（iii）OLFM4⁺中性粒細胞以及重組OLFM4蛋白惡化艱難梭菌毒素誘導的IEC損傷。總之，這些數據提示OLFM4是致病性中性粒細胞亞群的標志物，并暗示細胞外釋放的OLFM4通過影響IEC屏障在惡化CDI中的作用。在細胞培養中，從WT小鼠分離的中性粒細胞表現出