在免疫系統的精密防御網絡中，T細胞扮演著核心角色。傳統上，CD8⁺T細胞被認為是主要的“殺手”細胞，負責清除受感染的細胞或癌細胞。然而，另一類不那么為人所知的“殺手”——CD4⁺細胞毒性T淋巴細胞（CD4-CTLs），雖然早在幾十年前就被發現存在于多種感染性疾病、癌癥和自身免疫病中，但其起源、發育路徑和功能潛力始終籠罩在迷霧之中。與CD8-CTLs相比，CD4-CTLs的研究相對滯后，這限制了其在疫苗設計、免疫治療等領域的應用潛力。一個核心的科學問題是：CD4⁺T細胞，通常以“輔助”功能著稱，是如何獲得強大的細胞毒性能力的？它們的“記憶”是如何形成和維持的？是否存在一個長期的“干細胞樣”記憶庫，能夠快速響應威脅，分化為效應細胞？解答這些問題，對于理解適應性免疫的全面性以及開發新的治療策略至關重要。發表在《SCIENCE ADVANCES》上的這項研究，正是為了撥開這重重迷霧。

研究人員綜合運用了流式細胞術、體外T細胞極化培養模型、RNA測序（RNA-seq）、T細胞受體測序（TCR-seq）、 assay for transposase-accessible chromatin using sequencing（ATAC-seq，用于分析染色質開放性）、單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞ATAC測序（scATAC-seq）等多種技術手段。研究樣本來源于健康捐贈者的外周血單核細胞（PBMCs）。

通過對來自相同供體的CD4-CTLs（主要富集于CD4-T_EMRA效應記憶亞群）和CD8-CTLs（CD8-T_EMRA）進行平行分析，轉錄組學和蛋白質表達水平（如GZMB, PRF1, GNLY, CX3CR1, GPR56等）的比較表明，兩者在細胞毒性相關基因的表達上高度相似，主成分分析（PCA）中聚集在一起，基因集富集分析（GSEA）也未顯示顯著差異。TCR repertoire分析進一步揭示，兩者均呈現高度的克隆擴增，表明它們都是抗原驅動的效應細胞。這些結果表明，CD4-CTLs擁有與經典CD8-CTLs相媲美的細胞毒性潛力。

為了追溯CD4-CTLs的發育譜系，研究人員深入分析了CD4⁺T細胞的各個記憶亞群（T_N, T_SCM, T_CM, T_EM, T_EMRA-P, T_EMRA-E）的轉錄組和染色質開放性（ATAC-seq）。研究發現，干細胞記憶T細胞（T_SCM）同時高表達與長期存活/干細胞特性相關的基因（如TCF7, CD27）和細胞毒性效應基因（如GZMB, PRF1），表現出獨特的“雙重特征”。TCR克隆型共享分析顯示，效應性CD4-T_EMRA-E中擴增的克隆型在T_SCM亞群中有顯著共享，提示T_SCM可能是CD4-CTLs的前體細胞。

通過scRNA-seq和scATAC-seq對T_SCM細胞進行高分辨率解析，發現其內部存在高度異質性。其中，兩個特定的細胞簇（簇11和12）特異性地高表達細胞毒性分子（GZMB, GNLY, PRF1）和關鍵轉錄因子（如TBX21, ZEB2, ZNF683），被定義為T_SCM-CTL細胞。scATAC-seq分析顯示，這些細胞的染色質在細胞毒性基因的調控區域和基因體區域呈現更高的開放性，并且富集了T-bet、EOMES等細胞毒性相關轉錄因子的結合 motif，表明其表觀遺傳狀態已為細胞毒性程序的啟動做好了準備。此外，這些T_SCM-CTL細胞共表達TOX和PD1，類似于CD8⁺T細胞中描述的干細胞樣前體細胞。

整合scRNA-seq和配對scTCR-seq數據分析T_SCM和T_EMRA細胞，發現T_SCM-CTL細胞（對應于整合數據中的簇13和14）與CD4-T_EMRA效應細胞共享大量TCR克隆型。這些共享的克隆型在T_SCM中頻率很低，但在T_EMRA中高度擴增，提供了強有力的證據，表明T_SCM-CTL是CD4-CTL效應細胞在體內的直接前體。

研究人員建立了一個體外分化模型，通過在T_H1極化條件（IL-12, IFN-γ, 抗IL-4/IL-17抗體）下反復刺激純真的CD4⁺T_N細胞，成功誘導其表達細胞毒性分子（GZMB, PRF1, GNLY），并具備殺傷靶細胞的能力。scRNA-seq追蹤分化過程顯示，細胞經歷了從純真狀態到效應狀態的轉變，并鑒定出具有不同細胞毒性水平的中間群體。scATAC-seq分析進一步揭示了伴隨分化過程，細胞毒性基因位點的染色質開放性逐漸增加，重現了體內T_SCM-CTL到T_EMRA-E的表觀遺傳變化軌跡。

對比實驗表明，以T_SCM細胞為起始群體進行T_H1極化，比從T_N細胞開始，能更快速地獲得高表達細胞毒性分子的效應細胞，并且克隆擴增更為顯著。這進一步支持了T_SCM，特別是其中的T_SCM-CTL亞群，是更接近效應階段的CD4-CTL前體。

本研究系統性地闡明了人類CD4-CTLs的發育譜系，首次鑒定出存在于CD4⁺T_SCM記憶庫中的、預先決定向細胞毒性命運分化的T_SCM-CTL亞群。研究證實CD4-CTLs在分子水平上與CD8-CTLs同樣強大，破除了對其細胞毒性潛能的質疑。通過體外分化模型，研究不僅驗證了從T_N經T_SCM-CTL到效應細胞的線性發育路徑，還揭示了其背后動態的表觀遺傳重編程過程。

這項研究的發現具有多重重要意義：首先，它深化了對CD4⁺T細胞功能多樣性和記憶形成的理解。其次，它表明在疫苗設計和評估中，應同時關注CD4-CTLs和CD8-CTLs的反應，這可能為針對某些免疫逃逸策略的病原體提供更有效的保護。再者，鑒定出的T_SCM-CTL亞群及其關鍵調控因子，為開發基于CD4-CTLs的過繼性細胞療法（如用于癌癥治療）提供了新的細胞來源和靶點。最后，建立的體外高效生成具有長期存活潛力的CD4-CTLs的方法，為將其轉化為臨床應用鋪平了道路。總之，該研究為探索CD4-CTLs在感染性疾病、癌癥和自身免疫病等多種疾病中的治療潛力奠定了堅實的理論基礎和技術支撐。