準確高效的臨床樣本分析在生命科學和醫學診斷中起著至關重要的作用。循環體液中的核酸（如ctDNA、mRNA和miRNA）是寶貴的生物標志物，能夠實現遺傳疾病的動態實時監測、傳染病的預防以及腫瘤免疫療法的進步。通過液體活檢對這些分子進行定量分析具有顯著優勢，包括相對的分子穩定性、非侵入性以及可重復采樣的可能性[1]。在過去的幾十年里，定量聚合酶鏈反應（qPCR）由于其在核酸擴增方面的卓越靈敏度和可靠性，已成為分子診斷的金標準。為了克服與熱循環相關的儀器和技術限制，人們開發了一系列等溫擴增技術，包括環介導等溫擴增（LAMP）、重組酶聚合酶擴增（RPA）和滾環擴增（RCA）[3]、[4]。隨著對先進生物分析工具需求的增長以及全球健康挑戰（如COVID-19大流行）的持續存在[2]，該領域最近取得了進展，這些進展旨在實現超高靈敏度、特異性和多功能性，同時個性化診斷在中心實驗室和即時檢測（POC）環境中也得到了快速發展。

成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）系統最初在細菌中被發現，其功能在于識別特定核酸序列后激活核酸酶，并已成為具有多種生物功能的強大分子工具[5]。由于CRISPR系統的卓越效率、精確性和可編程性，它們已經發展成為一種變革性的工具包，在基因工程、生物成像和體外診斷（IVD）中有著廣泛的應用[6]。其中，Cas12a和Cas13a能夠精確識別目標核酸并介導位點特異性的順式切割，隨后觸發對單鏈DNA或RNA的強效非特異性反式切割活性[7]、[8]。利用這些優越特性，已經建立了多種基于CRISPR的即時檢測（POCT）平臺，包括DETECTR（DNA內切酶靶向CRISPR轉錄報告系統）[9]、HOLMES（低成本多功能高效系統）[10]和SHERLOCK（高靈敏度酶報告系統）[11]，用于靈敏且準確地檢測DNA和RNA。與傳統依賴昂貴儀器和熟練人員的PCR方法相比，CRISPR/Cas檢測方法操作簡便，便于開發便攜式即用型診斷試劑盒。然而，基于CRISPR的技術尚未像PCR那樣在臨床上得到廣泛應用，主要是由于其靈敏度存在固有限制。在臨床樣本中，ctDNA、miRNA和病毒RNA等核酸生物標志物的濃度通常非常低，常常低于CRISPR/Cas系統的檢測閾值[9]、[12]、[13]。為了解決這一挑戰，人們通過蛋白工程、crRNA修飾、報告基因優化以及添加化學物質或緩沖液等方式，致力于提高Cas蛋白的crRNA觸發反式切割活性，這些措施共同顯著提升了檢測靈敏度。CRISPR系統的模塊化結構使得這些策略能夠協同作用，有可能將其分析靈敏度推向理論極限。因此，及時且系統地回顧這些進展對于全面了解當前進展、評估現有方法的優缺點以及加速基于CRISPR的診斷技術的臨床轉化至關重要。

本文總結了在無擴增條件下提高CRISPR/Cas檢測靈敏度的現有策略，特別是那些使用Cas12和Cas13的方法。開發更有效的策略來增強Cas的反式切割活性需要全面理解該蛋白的結構和機制基礎。為此，我們以Cas12a為例，說明了CRISPR系統的分子結構和激活機制。本節探討了CRISPR/Cas的分類和結構特征、從crRNA結合到目標搜索的酶促途徑，以及RuvC催化域在介導反式切割活性中的功能作用。基于這一機制理解，我們總結了提高內在檢測靈敏度的五個關鍵要素，包括Cas蛋白工程、crRNA或DNA修飾、報告基因底物優化、反應添加劑以及酶級聯耦合（圖1）。最后，我們討論了開發超靈敏CRISPR/Cas技術的剩余挑戰和新興機遇，強調了它們在推進臨床診斷和實現下一代生物傳感策略方面的潛力。