子癇前期（Preeclampsia, PE）是一種影響3%-7%妊娠的嚴重妊娠期并發癥，是全球范圍內導致孕產婦和胎兒發病及死亡的主要原因之一。根據發病時間，PE可分為早發型（妊娠34周前）和晚發型。早發型PE病情更為嚴重，以血壓升高和蛋白尿為特征，且無法完全預防。滋養細胞侵襲不足、子宮螺旋動脈重鑄障礙、胎盤功能障礙和內皮功能紊亂是早發型PE的主要病理特征。

自噬（Autophagy）是一種基本的生物過程，負責細胞成分的降解和循環利用。在妊娠早期，自噬在胚胎發生和正常胚胎發育中扮演關鍵角色。然而，在缺氧條件下，自噬會加速滋養細胞衰老，加劇其功能障礙。臨床研究表明，LC3B介導的自噬在PE發病機制中發揮作用。PE孕婦胎盤及缺氧條件下的滋養細胞中自噬水平上調，提示抑制自噬可能成為PE的潛在治療策略。然而，自噬在PE滋養細胞中的確切作用及其觸發因素尚不清楚。

腫瘤抑制蛋白p53結合蛋白2（TP53BP2）基因編碼的蛋白在調節細胞凋亡中起主要作用。內源性TP53BP2具有損傷誘導性，可調節涉及多種細胞功能的生理損傷反應通路。近期研究發現，TP53BP2在多種腫瘤中過表達，是腫瘤發生和發展的關鍵因子。此外，TP53BP2通過其N端結構域（與ATG12和LC3具有高度結構相似性）調控自噬。研究表明，TP53BP2在低濃度gp120下抑制自噬，而在高濃度gp120下誘導自噬，提示其調控自噬具有濃度依賴性。鑒于滋養細胞侵襲受損和螺旋動脈重鑄不全是PE的主要原因，TP53BP2的異常表達和雙重功能使其可能通過調控自噬參與PE發病。

胎盤形成過程中的異常DNA甲基化是與PE相關的最重要表觀遺傳因素。組蛋白修飾（如乙酰化）的改變也可導致PE發生。基因表達受DNA甲基化標記或轉錄因子結合位點等多種因素調控。在組蛋白修飾中，組蛋白甲基化是一種復雜的表觀遺傳機制，可通過改變染色體結構激活或抑制靶基因轉錄。DNA甲基化通過抑制基因轉錄調控基因表達，同時修飾染色質結構并與其他表觀遺傳修飾相互作用，實現更復雜的基因表達調控。在哺乳動物中，體細胞DNA甲基化模式主要由DNMT1活性決定。DNMT1與G9a之間的直接相互作用被認為在DNA復制過程中協調DNA甲基化和H3K9甲基化。

轉錄因子E2F1是E2F家族成員，參與細胞周期進程、細胞分化和DNA修復的調控。證據表明，E2F1和/或E2F2與CpG島的特異性結合通過核小體耗竭保護基因免受從頭DNA甲基化。此外，在乳腺癌中，E2F1表達增加和E2F1結合基序的CpG羥甲基化共同誘導ESRP1表達。尋找異常的DNA（低/高）甲基化可能是發現與PE相關的新標志物、預測和理解PE發展的合理途徑。

本研究收集了2017年至2021年間在寧夏醫科大學總醫院接受剖宮產的85例孕婦胎盤組織。PE定義為妊娠20周后，兩次測量（間隔至少6小時）收縮壓（SBP）≥140 mmHg和舒張壓（DBP）≥90 mmHg，并伴有蛋白尿（≥0.3 g/24 h）。非PE妊娠志愿者（n=40）的胎盤作為對照。PE妊娠組（n=45）胎盤來自早發型PE（<34周）孕婦。排除標準包括多胎妊娠、胎兒先天性畸形或染色體異常、近期感染、抗磷脂抗體陽性、創傷、妊娠期藥物或酒精濫用、妊娠20周前高血壓、有PE病史的血栓形成傾向、抗凝/抗聚集治療史、吸煙以及產科檢查數據不完整。

動物實驗使用斯潑累格·多雷（Sprague-Dawley, SD）大鼠（13-14周齡）。通過手術誘導子宮灌注壓降低（RUPP）建立PE模型。在妊娠第14天（GD14），大鼠在戊巴比妥麻醉下接受RUPP手術。簡言之，切開腹腔暴露腹主動脈下端，在髂動脈分叉上方放置銀夾（0.203 mm）使主動脈血流減少約40%。同時在子宮弓的卵巢端用銀夾（0.100 mm）減少雙側子宮動脈的卵巢側支循環程度。假手術組接受相同操作但不放置銀夾。構建攜帶TP53BP2短發夾RNA（shRNA）、DNMT1 shRNA和G9a shRNA的重組腺相關病毒（AAV）血清型9載體，或攜帶陰性對照（AAV-shNC）的載體，將其注射入胎盤。在GD20處死大鼠，取出胎仔稱重，胎盤保存于-80°C備用。

細胞實驗使用HTR-8/SVneo和JEG-3細胞系。細胞在含10%胎牛血清（FBS）和抗生素-抗真菌溶液的RPMI-1640或Ham's F-12培養基中，于37°C、5% CO₂條件下培養。為模擬嚴重缺氧，細胞在1% O₂、5% CO₂條件下培養48小時。使用重組腺病毒載體進行TP53BP2、DNMT1、E2F1和G9a的過表達，或使用慢病毒載體進行相應基因的敲低。

為闡明早發型PE胎盤滋養細胞自噬的分子機制，研究人員通過RNA測序（RNA-seq）比較了早發型PE孕婦與非PE孕婦胎盤組織中自噬相關差異表達基因（DEGs）。功能相關基因主要富集在自噬相關信號通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt、AMPK和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路。聚類熱圖顯示了PE胎盤自噬相關信號通路中前20個DEGs，其中TP53BP2是最強的誘導因子。與非PE孕婦相比，TP53BP2在PE孕婦胎盤中的表達顯著上調。免疫組織化學（IHC）和免疫熒光染色進一步證實了TP53BP2在PE妊娠滋養細胞中的上調。

為研究TP53BP2的功能，研究人員在HTR8/Svneo和JEG-3細胞中通過轉染Ad-TP53BP2或三種獨立的sh-TP53BP2構建體進行TP53BP2的過表達和敲低。結果顯示，轉染Ad-TP53BP2后，TP53BP2的mRNA和蛋白水平顯著增加。在三種獨立的sh-TP53BP2構建體中，sh-TP53BP2 (#3)在兩種細胞系中均表現出最高的敲低效率，因此后續實驗均使用此構建體。透射電子顯微鏡（TEM）結果顯示，轉染Ad-TP53BP2的滋養細胞中自噬體和自噬溶酶體形成增加，而轉染sh-TP53BP2則出現相反效果。使用串聯熒光GFP-RFP-LC3的自噬流檢測顯示，轉染sh-TP53BP2的滋養細胞中總自噬體和自噬溶酶體形成減少。Western blotting分析證實了TP53BP2對缺氧條件下HTR8/SVneo和JEG-3細胞中LC3B-II和p62水平的影響。這些結果表明，TP53BP2上調可增加PE胎盤中的滋養細胞自噬。

基于體外研究結果，研究人員通過在GD14誘導大鼠RUPP建立PE模型，以研究TP53BP2的作用。使用攜帶TP53BP2 shRNA（AAV-shTP53BP2）的重組AAV9載體敲低PE大鼠的TP53BP2，導致血壓降低、蛋白尿減少和胎兒體重增加。蘇木精-伊紅（H&E）染色也顯示該大鼠模型中蛻膜細胞的水樣變性和纖維蛋白沉積減少。此外，TP53BP2下調的PE大鼠胎盤顯示LC3B-II表達降低和p62表達增加。免疫熒光染色和IHC染色結果一致。這些結果表明，TP53BP2敲低可減弱PE大鼠胎盤滋養細胞的自噬。

為探究自噬涉及的分子，研究人員對TP53BP2敲低的HTR8/SVneo細胞進行了RNA-seq。結果顯示1046個分子上調和1035個分子下調。基因本體（GO）分析表明這些分子參與自噬、ATP結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、mTOR信號、HIF1信號通路和AMPK信號。qRT-PCR檢測前10個下調基因的水平，結果顯示自噬關鍵標志物Beclin-1在PE大鼠胎盤中的水平顯著降低。

為確認Beclin-1在TP53BP2誘導的自噬中的作用，研究人員構建了三種獨立的sh-Beclin-1并轉導至HTR8/SVneo和JEG-3細胞。結果顯示，轉導sh-Beclin-1 (#1)后，Beclin-1的mRNA和蛋白表達水平顯著降低。共轉染sh-Beclin-1和Ad-TP53BP2導致HTR8/SVneo和JEG-3細胞中LC3B-II水平降低和p62表達增加。Bcl-2與自噬啟動子Beclin-1相互作用。既往研究表明，Beclin-1從Bcl-2-Beclin-1復合物中釋放啟動了TP53BP2誘導的自噬。本研究探討了Bcl-2與Beclin-1的BH3結構域結合在TP53BP2誘導的滋養細胞自噬中的作用。CoIP顯示，在缺氧條件下，HTR8/SVneo和JEG-3細胞中TP53BP2與Bcl-2的相互作用增加，而Beclin-1與Bcl-2的相互作用被破壞。相反，TP53BP2敲低增加了Beclin-1與Bcl-2的相互作用。這些結果表明，TP53BP2敲低通過降低Beclin-1表達和促進Beclin-1與Bcl-2的相互作用來抑制滋養細胞自噬。

為探討TP53BP2在PE進展中的臨床意義，研究人員收集了85例早發型PE妊娠（<34周；n=45）和非PE妊娠（n=40）的胎盤。兩組在孕產婦年齡或胎兒性別上無顯著差異。然而，PE妊娠組的SBP、DBP和蛋白尿顯著升高。此外，PE妊娠組的孕產婦體重指數（BMI）顯著高于非PE妊娠組。與非PE妊娠相比，PE妊娠與分娩孕周（GAD）降低和新生兒出生體重（NBW）較低相關。為評估TP53BP2在胎盤功能障礙中的意義，分析了胎盤中TP53BP2與LC3B-II和p62的相關性。結果顯示，在PE和非PE妊娠中，TP53BP2與LC3B-II水平呈正相關，與p62呈負相關。此外，胎盤TP53BP2水平與SBP、DBP和BMI呈正相關，與GAD和NBW呈負相關。ROC分析表明，TP53BP2診斷PE妊娠的曲線下面積（AUC）值最高，為0.882。因此，這些結果提示TP53BP2可能是與PE妊娠臨床病理特征相關的預測性生物標志物。

首先，研究人員利用UCSC數據庫分析TP53BP2啟動子的基因組序列，以評估表觀遺傳調控對其表達的影響。正如預期，TP53BP2啟動子的CpG島含有高比例的GC堿基。MethPrimer程序識別出一個長1240 bp的單一CpG島，該島橫跨轉錄起始位點-599至+641位置，CG含量為50%，CpG比率為0.6，位于TP53BP2的5′側翼區域遠端，可能通過甲基化調控TP53BP2水平。

隨后，將TP53BP2的5′側翼區域的幾個片段插入熒光素酶載體pGL3中，熒光素酶活性測定結果顯示，片段-599/-35（涵蓋TP53BP2啟動子大部分CpG二核苷酸）表現出最高的啟動子活性。一致地，熒光素酶測定顯示，轉染含有片段-599/-35的pGL3熒光素酶報告基因后，HTR8/SVneo和JEG-3細胞中TP53BP2的轉錄活性增加，表明該區域是TP53BP2的核心調控區域。

為檢驗DNA甲基化是否直接抑制TP53BP2啟動子活性，研究人員從-599/-35克隆了TP53BP2近端啟動子區域。使用甲基化酶SssI (M.SssI)、HhaI (M.HhaI)和HpaII (M.HpaII)對克隆的插入片段進行甲基化。SssI用于甲基化所有51個5′-CpG-3′序列內的CpG位點，HhaI僅甲基化9個5′-GCGC-3′序列內的CpG位點，HpaII甲基化3個5′-CCGG-3′序列內的CpG位點。通過用限制性內切酶McrBC（甲基化特異性限制酶）、HhaI和HpaII（甲基化敏感限制酶）消化證實了片段的正確甲基化。將熒光素酶報告載體轉染滋養細胞后的熒光素酶測定顯示，三種甲基化酶處理均降低了TP53BP2啟動子活性，其中SssI甲基化酶的抑制作用最顯著。

接下來，使用MSP檢測TP53BP2 DNA甲基化水平的差異。結果顯示，PE孕婦胎盤和缺氧條件下的滋養細胞中全局DNA甲基化水平降低。BSP進一步顯示，在缺氧條件下，HTR8/SVneo細胞中TP53BP2啟動子-599/-35區域內的DNA甲基化水平顯著降低。這些結果表明，DNA低甲基化調控了PE妊娠胎盤滋養細胞中TP53BP2的轉錄激活。

為確定參與DNA甲基化的關鍵酶，研究人員在缺氧條件下用DC_05（DNMT1抑制劑）、茶黃素-3,3′-雙沒食子酸酯（TFD；DNMT3a抑制劑）或納米霉素A（NA；DNMT3b抑制劑）處理HTR8/SVneo細胞。結果顯示，DC_05處理（而非TFD或NA）導致缺氧條件下HTR8/SVneo細胞中TP53BP2啟動子的DNA甲基化水平顯著降低。為進一步確認DNMT1在調控TP53BP2 DNA甲基化中的作用，研究人員通過轉導三種獨立的sh-DNMT1構建體構建了DNMT1敲低的HTR8/SVneo細胞。結果顯示，轉導sh-DNMT1 (#1)后，DNMT1的mRNA和蛋白表達顯著降低。結果表明，DNMT1敲低降低了TP53BP2啟動子的DNA甲基化水平，并增加了TP53BP2的轉錄活性和蛋白水平。這些結果提示，DNMT1介導的DNA甲基化強烈抑制TP53BP2表達。

據報道，TP53BP2是E2F1的直接靶標。本研究中，qRT-PCR和Western blotting檢測顯示，與非PE孕婦相比，E2F1在PE孕婦胎盤中的水平顯著增加。免疫熒光染色進一步證實了這一發現。接下來，研究人員通過構建E2F1過表達或敲低來檢測E2F1對TP53BP2表達的影響。結果顯示，轉染Ad-E2F1后，E2F1的mRNA和蛋白水平顯著增加。在三種獨立的sh-E2F1構建體中，sh-E2F1 (#3)在HTR8/Svneo細胞中表現出最高的敲低效率。E2F1過表達和敲低分別增加和抑制了缺氧條件下HTR8/SVneo細胞中TP53BP2的表達。

此外，使用抗E2F1抗體的ChIP assay顯示，在缺氧條件下，E2F1在TP53BP2啟動子處顯著富集。接下來，研究人員使用JASPAR數據庫計算TP53BP2啟動子中低甲基化CpG位點周圍的推定轉錄因子結合元件。在TP53BP2啟動子中鑒定出三個推定的E2F1結合位點（-33/-22, -99/-88, 和 -368/-357）。ChIP assay顯示E2F1與TP53BP2啟動子在-33/-22, -99/-88, 和 -368/-357位點顯著結合。此外，熒光素酶報告基因測定顯示，突變-33/-22 (Mut1), -99/-88 (Mut2), 和 -368/-357 (Mut3)位點后，TP53BP2啟動子的活性顯著降低。

甲基轉移酶可通過直接與轉錄因子相互作用調控靶基因表達。采用CoIP方法研究DNMT1與E2F1之間的關系。與先前報道一致，DNMT1在缺氧條件下的滋養細胞中與E2F1發生物理相互作用。此外，ChIP assay進一步顯示，DNMT1敲低增加了E2F1在TP53BP2啟動子處的富集。該結果表明DNMT1介導了E2F1與TP53BP2啟動子的結合。總之，這些結果提示DNMT1抑制E2F1與TP53BP2啟動子的結合，導致缺氧條件下滋養細胞自噬減少。

組蛋白修飾在調控基因轉錄中起重要作用。本研究利用UCSC基因組瀏覽器中的ENCODE組蛋白修飾軌道，鑒定了TP53BP2啟動子區域的七種組蛋白修飾（H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me2, H3K9me3, H3K27me3 和 H3K36me3）。在這些組蛋白修飾中，H3K4me2和H3K4me3顯示出最多的富集峰。使用ChIP assay，研究人員檢測到在缺氧條件下，HTR8/SVneo細胞中H3K9me2在TP53BP2啟動子處的富集顯著減少，而其他組蛋白修飾無此變化。免疫熒光染色顯示PE孕婦胎盤滋養細胞中H3K9me2水平顯著降低。該結果證實了H3K9me2在PE妊娠滋養細胞TP53BP2轉錄中的重要性。

此外，通過測量幾種廣泛認可的組蛋白甲基轉移酶（包括G9a、LSD1、SUV39H1和SUV39H2）的水平，研究人員檢測到PE孕婦胎盤和缺氧條件下的HTR8/SVneo細胞中G9a水平顯著降低。接下來，研究人員通過建立G9a敲低的HTR8/Svneo細胞來研究G9a對TP53BP2表達的影響。在三種獨立的sh-G9a構建體中，sh-G9a (#3)在HTR8/Svneo細胞中表現出最高的敲低效率。體外實驗顯示，G9a敲低顯著增強了缺氧條件下HTR8/Svneo細胞中TP53BP2的轉錄。類似地，用BIX-01294（G9a特異性抑制劑）處理增加了缺氧條件下HTR8/SVneo細胞中TP53BP2的水平。這些數據證明G9a可以抑制PE妊娠患者胎盤中TP53BP2的表達。

為闡明DNMT1和G9a在調控TP53BP2表達中的潛在關系，研究人員通過轉染Ad-DNMT1和/或Ad-G9a在HTR8/SVneo細胞中過表達DNMT1或G9a。DNMT1或G9a表達降低了E2F1與TP53BP2啟動子的結合，而DNMT1和G9a共過表達進一步減弱了這種結合。此外，G9a和DNMT1敲低顯著降低了缺氧條件下HTR8/SVneo細胞中TP53BP2的DNA甲基化水平和H3K9me2在TP53BP2啟動子處的富集，最終導致TP53BP2轉錄和蛋白表達顯著上調。在缺氧條件下用DC_05和/或BIX處理的HTR8/SVneo細胞中也觀察到類似結果。

值得注意的是，將AAV-shG9a和/或AAV-shDNMT1注射到PE大鼠胎盤后，H&E染色顯示胎盤損傷顯著增加。此外，注射AAV-shG9a和/或AAV-shDNMT1的PE大鼠顯示血壓和尿蛋白水平顯著升高，提示G9a和DNMT1在胎盤功能障礙中對E2F1與TP53BP2啟動子結合的協同抑制作用。

接下來，研究人員研究了滋養細胞中E2F1、DNMT1和G9a之間的相互作用。CoIP assay顯示，在缺氧條件下，DNMT1與G9a和E2F1發生物理相互作用，而G9a與E2F1之間幾乎無相互作用。免疫熒光染色顯示，DNMT1和G9a與E2F1在HTR8/SVneo細胞核中共定位。

考慮到DNMT1的多功能結構域，研究人員構建了一系列DNMT1的截短構建體，并將編碼不同GST標記的DNMT1片段（GST-control, GST-WT, GST-1-446, GST-431-703, GST-643-835, GST-836-1060, 和 GST-1061-1632）的質粒與編碼Myc標記的G9a（Myc-G9a）或Flag標記的E2F1（Flag-E2F1）的質粒共轉染到HEK293細胞中。CoIP assay顯示，DNMT1的1–446區域與G9a相互作用，而DNMT1的1061–1632區域與E2F1相互作用。

最重要的是，熒光素酶報告基因測定顯示，轉染Δ1–446突變的HTR8/SVneo細胞中TP53BP2轉錄活性顯著增加，而轉染Δ1061–1632突變則降低了其轉錄活性。此外，構建了缺失與G9a（Δ1–446）或E2F1（Δ1061–1632）相互作用區域的DNMT1質粒，并將其轉染到HTR8/SVneo細胞中。有趣的是，刪除DNMT1的1–446區域顯著增加了缺氧條件下HTR8/SVneo細胞中E2F1在TP53BP2啟動子處的富集，同時減少了DNMT1在TP53BP2啟動子處的富集。相反，刪除DNMT1的1061–1632區域促進了E2F1與TP53BP2啟動子的結合，并增強了H3K9me2的富集。總之，這些結果表明G9a與DNMT1之間的相互作用抑制了E2F1介導的滋養細胞中TP53BP2的激活。

子癇前期（PE）是導致孕產婦和胎兒發病的主要原因，其病理與胎盤功能障礙和