《Plant Biotechnology Journal》：Rare Natural SNP Activates SHOOT APICAL MERISTEM ENLARGER1 to Increase Branch Number and Silique Number on the Main Inflorescence in Brassica napus
編輯推薦：
本研究克隆了一個(gè)同時(shí)調(diào)控甘藍(lán)型油菜分枝數(shù)（BN）和主花序角果數(shù)（SMI）的主效QTL位點(diǎn)qDB.A09，其因果基因SAME1（SHOOT APICAL MERISTEM ENLARGER1）編碼一個(gè)MULE轉(zhuǎn)座酶來源的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，位于SAME1下游1.4 kb處的一個(gè)罕見C-to-A單核苷酸多態(tài)性（SNP1055）與其在莖頂端分生組織（SAM）中表達(dá)升高相關(guān)，通過抑制BnaC06.ARR15表達(dá)并擴(kuò)大BnaA09.WUS表達(dá)域，最終導(dǎo)致SAM增大、BN和SMI顯著增加，單株產(chǎn)量提升22.05%。該研究為甘藍(lán)型油菜產(chǎn)量性狀的遺傳改良提供了新的遺傳位點(diǎn)。
1 引言
甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）是全球重要的油料作物。分枝數(shù)（BN）和主花序角果數(shù)（SMI）是與產(chǎn)量密切相關(guān)的數(shù)量性狀。提高這些性狀可顯著增加單株角果總數(shù)，進(jìn)而提升產(chǎn)量。此前，已有研究定位到多個(gè)與BN和SMI相關(guān)的QTL，但尚未有成功克隆的報(bào)道。莖頂端分生組織（SAM）是產(chǎn)生所有地上部分的來源，其大小和形態(tài)深刻影響營養(yǎng)分枝和繁殖器官數(shù)量。在擬南芥、水稻、番茄和玉米等作物中，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)調(diào)控SAM大小的關(guān)鍵基因（如CLV3、WUS等）。本研究旨在克隆調(diào)控甘藍(lán)型油菜BN和SMI的主效QTL qDB.A09，并解析其分子機(jī)制。
2 結(jié)果
2.1 qDB.A09位點(diǎn)通過調(diào)控SAM大小影響B(tài)N和SMI
通過構(gòu)建近等基因系（NIL），發(fā)現(xiàn)攜帶db1（稠密分枝1）等位基因的NILdd材料，其BN（12.40 ± 1.24）和SMI（124.22 ± 25.57）均極顯著高于NILDD（BN: 9.00 ± 1.25; SMI: 71.07 ± 15.71），單株種子產(chǎn)量增加22.05%。石蠟切片和掃描電鏡分析表明，NILdd在幼苗期（5、17、30天）和花過渡期的SAM面積均顯著大于NILDD，且花過渡期的花序分生組織更大，周圍形成更多花分生組織和花原基。
2.2 qDB.A09的圖位克隆
利用包含38,010個(gè)個(gè)體的分離群體，將qDB.A09精細(xì)定位到A09染色體上一個(gè)7 kb的區(qū)間。該區(qū)間在ZS11參考基因組中存在一個(gè)10,387 bp的插入，僅在db1和NILdd中存在，而在T109和NILDD中缺失。基因預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該插入中含有一個(gè)新基因，命名為SHOOT APICAL MERISTEM ENLARGER1（SAME1）。其與ZS11的唯一區(qū)別是位于基因下游1.4 kb處的一個(gè)SNP（SNP1055），在ZS11中為C，在db1和NILdd中為A。該SNP與SAME1在SAM中的高表達(dá)相關(guān)，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)SNP1055為A時(shí)能顯著增強(qiáng)啟動(dòng)子活性。
2.3 SAME1正向調(diào)控甘藍(lán)型油菜的BN和SMI
在NILDD中過表達(dá)SAME1-SNP1055A構(gòu)建體（proSAME1:SAME1-SNP1055A），獲得的互補(bǔ)株系SAME1-CO#1和SAME1-CO#2的SAM面積、BN、SMI、分枝密度（BD）和主花序角果密度（SD）均顯著增加。利用CRISPR/Cas9技術(shù)在NILdd中敲除SAME1，獲得的兩個(gè)純合敲除株系SAME1-CR#1和SAME1-CR#2則出現(xiàn)SAM面積減小、BN和SMI顯著降低的表型。這些結(jié)果證實(shí)SAME1是qDB.A09的因果基因，并正向調(diào)控BN和SMI。
2.4 SAME1編碼一個(gè)在SAM中高表達(dá)的MULE轉(zhuǎn)座酶來源的轉(zhuǎn)錄因子
系統(tǒng)進(jìn)化分析表明SAME1是十字花科特有的基因，其編碼的蛋白包含一個(gè)Transposase_mut結(jié)構(gòu)域和一個(gè)SWIM鋅指結(jié)構(gòu)域，與MULE轉(zhuǎn)座酶衍生的轉(zhuǎn)錄因子家族（如FRS和MUSTANG）相似但存在差異。亞細(xì)胞定位顯示SAME1蛋白定位于細(xì)胞核，酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)表明其具有轉(zhuǎn)錄激活活性。qRT-PCR和原位雜交顯示SAME1在NILdd的SAM中特異性高表達(dá)，表達(dá)區(qū)域位于組織中心（organising centre）和中央?yún)^(qū)（central zone）的邊界區(qū)域。
2.5 SAME1通過影響BnaA09.WUS的表達(dá)來改變SAM大小
RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，在SAME1敲除株系中，有953個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）。GO富集分析顯示這些基因顯著富集于分生組織發(fā)育調(diào)控等過程。其中，BnaA09.WUS的表達(dá)在敲除株系中顯著下調(diào)，而A型反應(yīng)調(diào)節(jié)因子基因如BnaC06.ARR15等則顯著上調(diào)。原位雜交顯示在NILdd的SAM中，BnaA09.WUS的表達(dá)區(qū)域從組織中心擴(kuò)展至周邊區(qū)（peripheral zone）和組織中心上層。酵母單雜交（Y1H）、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)SAME1能直接結(jié)合到BnaC06.ARR15的啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)。而BnaC06.ARR15又能抑制BnaA09.WUS的啟動(dòng)子活性。這表明SAME1通過抑制BnaC06.ARR15的表達(dá)，從而解除對BnaA09.WUS的抑制，最終導(dǎo)致SAM增大。
2.6 利用qDB.A09改良優(yōu)良品種ZS11的BN和SMI
將qDB.A09位點(diǎn)導(dǎo)入優(yōu)良品種ZS11，獲得改良系ZS11-dd。與ZS11相比，ZS11-dd的SAM面積、BN和SMI均顯著增加，證明該位點(diǎn)在育種中具有應(yīng)用價(jià)值。
3 討論
本研究成功克隆了一個(gè)同時(shí)調(diào)控甘藍(lán)型油菜BN和SMI的主效QTL qDB.A09，其因果基因SAME1是一個(gè)MULE轉(zhuǎn)座酶衍生的轉(zhuǎn)錄因子。一個(gè)罕見的SNP（SNP1055）通過調(diào)控SAME1的表達(dá)，進(jìn)而通過BnaC06.ARR15-BnaA09.WUS通路影響SAM大小，最終調(diào)控分枝數(shù)和角果數(shù)。研究為甘藍(lán)型油菜產(chǎn)量性狀的遺傳改良提供了新的基因資源和理論依據(jù)。
4 材料與方法
研究使用了近等基因系、圖位克隆、CRISPR/Cas9基因編輯、RNA-seq、qRT-PCR、原位雜交、酵母單雜交、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等多種分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法對基因功能和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入解析。
