腫瘤一直以來都困擾著人類健康。隨著腫瘤免疫學(xué)理論的深入研究和技術(shù)的不斷進(jìn)步，腫瘤免疫治療有望實現(xiàn)腫瘤的根治性突破、成為腫瘤治療的主流方法。腫瘤免疫療法被稱為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種腫瘤療法，并于2013年被《科學(xué)》雜志評為年度最具價值的科學(xué)突破之一。腫瘤免疫療法中，CAR-T細(xì)胞療法備受矚目，截止到目前為止，國內(nèi)已上市8款CAR-T產(chǎn)品，全球已上市15款CAR-T產(chǎn)品。

CAR-T細(xì)胞療法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是CAR-T細(xì)胞的制備，慢病毒載體是CAR基因基因?qū)�入所使用的主要技術(shù)路線。CAR-T細(xì)胞的制備流程通常可被分為：外周血單核細(xì)胞（PBMC）采集，T細(xì)胞分離，T細(xì)胞激活，T細(xì)胞（體外）基因修飾，CAR-T細(xì)胞體外擴(kuò)增，CAR-T細(xì)胞質(zhì)量監(jiān)控及回輸，共6個主要步驟。在一般的技術(shù)路線中，T細(xì)胞的激活和基因修飾是獨立分開的兩個過程。Takara Bio可以提供一種新型可溶性微流體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)——Lenti-X™ T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿，讓CAR-T細(xì)胞構(gòu)建更高效。

基于新型生物支架技術(shù)的T-Cell轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿

Lenti-X T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿，是一種新型可溶性微流體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。依托于大孔徑的海藻酸鹽海綿狀3D結(jié)構(gòu)，可以做到一步完成T細(xì)胞活化和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個過程，既提高了時效性，又減少了對細(xì)胞的處理過程，對轉(zhuǎn)導(dǎo)需要的病毒量也更小，能夠?qū)崿F(xiàn)高效活化、高效轉(zhuǎn)導(dǎo)、高細(xì)胞活力，具有高實驗穩(wěn)定性和重復(fù)性。

Lenti-X T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，由具有高生物相容性的鈣離子交聯(lián)海藻酸鹽制成，融入了經(jīng)過優(yōu)化的T細(xì)胞活化試劑（重組人白介素2rhIL-2和抗人CD3/CD28抗體）混合物。大孔徑的海藻酸鹽孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑范圍在20-300 μm之間，無需借助儀器可實現(xiàn)微流體驅(qū)動的慢病毒高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)T細(xì)胞和病毒進(jìn)入轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿，T細(xì)胞活化劑會激活進(jìn)入的T細(xì)胞，大孔3D結(jié)構(gòu)通過共定位T細(xì)胞和病毒促進(jìn)轉(zhuǎn)導(dǎo)來提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。轉(zhuǎn)導(dǎo)完成后，使用特定緩沖液溶解海綿，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞就會被釋放出來。

Lenti-X T-Cell轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿工作原理

將靶標(biāo)細(xì)胞（T細(xì)胞或PBMCs）和慢病毒混合后，添加到T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿中，37°C孵育1小時，以使混合物被充分吸收。吸收完全后，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，37°C孵育48小時。

孵育完成后，加入專用的釋放緩沖液浸泡海綿，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞就可以輕松從海綿中釋放出來。在隨后的洗滌步驟中，完成轉(zhuǎn)導(dǎo)的海綿會被溶解，而這不會對細(xì)胞活力造成影響。這些細(xì)胞可以擴(kuò)大培養(yǎng)或者用于下游研究應(yīng)用。整個操作過程減少了對細(xì)胞的處理步驟，降低了對病毒的需求量，總反應(yīng)體積也更小，對用戶非常友好。使用T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿，可以獲得與傳統(tǒng)方法相當(dāng)或優(yōu)于傳統(tǒng)方法的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并且更容易獲得高度一致的實驗結(jié)果，實驗穩(wěn)定性和重復(fù)性高。

案例分享1——高效活化人原代T細(xì)胞

不同MOI情況下高效活化T細(xì)胞。

將表達(dá)綠色熒光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染復(fù)數(shù)（MOI=0，5，10，Average）和4 × 10⁶人原代T細(xì)胞進(jìn)行混合，分別添加至Lenti-X T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿（" T-cell sponge "）進(jìn)行活化，同時也使用CD3/CD28 Immunocult T細(xì)胞激活劑（"Conjugate"）活化T細(xì)胞作為平行比較。未經(jīng)激活處理的細(xì)胞作為陰性對照（"Unstim"）。48小時后，通過流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）分析檢測活化T細(xì)胞中CD69的表達(dá)情況。在本案例中，T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿實驗組CD69陽性率要高于Conjugate實驗組。

案例分享2——高效轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代T細(xì)胞

不同MOI情況下高效轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代T細(xì)胞。

將表達(dá)綠色熒光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染復(fù)數(shù)（MOI=0，5，10）和4 × 10⁶人原代T細(xì)胞進(jìn)行混合，分別添加至Lenti-X T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿（" T-cell sponge "）進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。Spinoculated樣品使用CD3/CD28 Immunocult T細(xì)胞激活劑活化2天，之后添加polybrene (8 µg/ml)作為轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑同時1,500 g離心90分鐘促進(jìn)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)（"Spinoculation"）。通過流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）分析指定時間點綠色熒光蛋白（GFP）ZsGreen1的表達(dá)情況來評估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。圖中顯示的百分比是轉(zhuǎn)導(dǎo)七天時GFP+的表達(dá)情況。在本實驗例中，T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿實驗組GFP+陽性率均高于Spinoculation方案實驗組。

案例分享3——轉(zhuǎn)導(dǎo)后依然保持高細(xì)胞活力

轉(zhuǎn)導(dǎo)后人原代T細(xì)胞依然保持高細(xì)胞活力。

將表達(dá)綠色熒光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染復(fù)數(shù)（MOI=0，5，10）和4 × 10⁶人原代T細(xì)胞進(jìn)行混合，分別添加至Lenti-X T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿（" T-cell sponge "）進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。Spinoculated樣品使用CD3/CD28 Immunocult T細(xì)胞激活劑活化2天，之后添加polybrene (8 µg/ml)作為轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑同時1,500 g離心90分鐘促進(jìn)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)（"Spinoculation"）。轉(zhuǎn)導(dǎo)后通過7-AAD染色法和流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）在指定時間點對細(xì)胞活力進(jìn)行分析。在本實驗例中，T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿實驗組依然保持較高的細(xì)胞活力，與Spinoculation方案實驗組水平相當(dāng)或者略高。

除了專用于T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿，Takara Bio還可以提供適用范圍廣譜的通用型轉(zhuǎn)導(dǎo)海綿，可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代T細(xì)胞、CD34+造血干細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、懸浮和貼壁細(xì)胞系等細(xì)胞類型，使用廣譜不局限，可塑性更強(qiáng)。Takara Bio作為重要的生物技術(shù)企業(yè)，在病毒基因?qū)�入系統(tǒng)方面體系完備，擁有慢病毒系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)、腺相關(guān)病毒系統(tǒng)、腺病毒全套解決方案，為相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供強(qiáng)力支持，為寄予厚望的細(xì)胞與基因治療研究護(hù)航加碼。

創(chuàng)新驅(qū)動夢想前行，技術(shù)創(chuàng)新，Takara Bio一直在路上。

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