牛津大學(xué)納菲爾德骨科、風(fēng)濕病學(xué)和肌肉骨骼科學(xué)系(NDORMS)的一個(gè)研究小組開(kāi)發(fā)了一種新方法，可以顯著提高RNA測(cè)序的準(zhǔn)確性。他們指出短讀和長(zhǎng)讀RNA測(cè)序中不準(zhǔn)確定量的主要來(lái)源，并引入了“majority vote”糾錯(cuò)的概念，從而大大提高了RNA分子計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

研究重點(diǎn)：

• 過(guò)往科學(xué)家沒(méi)有重視的PCR循環(huán)是很多精準(zhǔn)測(cè)序當(dāng)中的一個(gè)重要錯(cuò)誤源頭；

• 新研究發(fā)明了一種新型的同源三聚體的分子生物標(biāo)記法來(lái)達(dá)到精準(zhǔn)測(cè)序的目的。研究人員報(bào)告了再批量測(cè)序和單細(xì)胞測(cè)序下的99%和98%的測(cè)序精度。這稱之為幾乎逼近絕對(duì)精準(zhǔn)定量的測(cè)序水平。這是該領(lǐng)域目前最為精準(zhǔn)的糾錯(cuò)測(cè)序技術(shù)。

短讀和長(zhǎng)讀RNA測(cè)序目前主要存在的問(wèn)題

遺傳物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)序在現(xiàn)代生物學(xué)中是至關(guān)重要的，特別是對(duì)于理解和解決與遺傳異常有關(guān)的疾病方面。然而，目前的方法遇到了很大的限制。

論文一作Jianfeng Sun博士解釋道：“短讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在常規(guī)RNA測(cè)序中的精度是很高的，然而其在單細(xì)胞RNA測(cè)序中的精度根據(jù)不同的測(cè)序條件設(shè)置忽高忽低。比如，將PCR體外擴(kuò)增次數(shù)增高后再去測(cè)序的精度其實(shí)并不高。長(zhǎng)讀長(zhǎng)RNA測(cè)序目前在單細(xì)胞和常規(guī)RNA測(cè)序中的精度均比短讀長(zhǎng)要低一些。因?yàn)闇y(cè)序平臺(tái)在不斷推陳出新，所以目前在一般情況下開(kāi)展的測(cè)序精度不會(huì)出現(xiàn)過(guò)低的情況。

但是，無(wú)論短讀長(zhǎng)還是長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序中只要出現(xiàn)一定量的錯(cuò)誤，那么這可能就會(huì)潛在地影響數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量，從而可能潛在地影響生物研究結(jié)論。

所以最主要的問(wèn)題還是精度問(wèn)題。

另外，短讀長(zhǎng)測(cè)序的價(jià)格要比長(zhǎng)讀長(zhǎng)低很多。但是長(zhǎng)讀長(zhǎng)的價(jià)格普遍還是居高不下。如何在測(cè)序精度和價(jià)格之間尋找平衡是其中一個(gè)重要的議題。”

創(chuàng)新新方法

這項(xiàng)具有里程碑意義的研究由牛津大學(xué)計(jì)算生物學(xué)副教授Adam Cribbs和Jianfeng Sun領(lǐng)導(dǎo)完成，他們開(kāi)發(fā)了一種創(chuàng)新的方法，用于糾正高通量測(cè)序中廣泛出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤。

研究發(fā)表在《自然方法》(Nature Methods)雜志上，指出PCR人工產(chǎn)物是定量不準(zhǔn)確的主要原因，這解決長(zhǎng)期以來(lái)在生成準(zhǔn)確的RNA分子絕對(duì)計(jì)數(shù)方面所面臨的挑戰(zhàn)，這對(duì)基因組學(xué)研究的各種應(yīng)用至關(guān)重要。

在這篇文章中，研究人員重點(diǎn)研究了特異性分子標(biāo)記(Unique Molecular Identifiers, UMIs，生物通注)，這是一種隨機(jī)的寡核苷酸序列，用于消除PCR擴(kuò)增過(guò)程中引入的偏差。雖然UMIs已被廣泛應(yīng)用于測(cè)序方法，但該研究表明，PCR錯(cuò)誤可能會(huì)破壞分子定量的準(zhǔn)確性，特別是在不同的測(cè)序平臺(tái)上。

Sun說(shuō):“PCR擴(kuò)增對(duì)于大多數(shù)RNA測(cè)序技術(shù)來(lái)說(shuō)都是必不可少的，但它可能會(huì)引入誤差，損害數(shù)據(jù)的完整性。我們通過(guò)使用同源三聚體核苷酸塊合成UMI條形碼來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，增強(qiáng)了糾錯(cuò)能力，實(shí)現(xiàn)了近乎絕對(duì)的RNA分子定量，顯著提高了分子計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性�！�

“測(cè)序一般需要使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)分子序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后的分子進(jìn)入測(cè)序池子后會(huì)影響正確的分子計(jì)數(shù)。所以待測(cè)分子需要用一些分子序列條形碼對(duì)其進(jìn)行身份標(biāo)記，在PCR擴(kuò)增后進(jìn)行剔除。但是PCR這個(gè)過(guò)程會(huì)引入錯(cuò)誤，稱為PCR錯(cuò)誤。如果條形碼也錯(cuò)了，PCR擴(kuò)增的分子的正確識(shí)別可能就會(huì)遇到困難，所以可能會(huì)破壞分子定量的準(zhǔn)確性。在不同的測(cè)序平臺(tái)上，PCR錯(cuò)誤的影響是很不同的。例如，在短讀測(cè)序平臺(tái)，錯(cuò)誤率并不高。但是基于電信號(hào)識(shí)別堿基從而測(cè)序的牛津納米孔測(cè)序會(huì)相對(duì)高。”

“majority vote”方法

同源三聚體是由三個(gè)相同堿基組成的核苷酸序列，如AAA、CCC、GGG。通過(guò)評(píng)估同源三聚體核苷酸相似性，研究人員可以通過(guò)“majority vote”方法檢測(cè)和糾正錯(cuò)誤(圖1)。

圖1:顯示同源三聚體UMI majority vote錯(cuò)誤糾正的示意圖。我們用同源三聚體核苷酸塊(由AAA、CCC、GGG、TTT組成的組合)構(gòu)建了UMIs。通過(guò)評(píng)估三聚體核苷酸的相似性，通過(guò)“majority vote”系統(tǒng)識(shí)別和糾正刪除、插入或替代的錯(cuò)誤，選擇最常見(jiàn)的核苷酸。

“‘majority vote’糾錯(cuò)這一概念具體是指使用多數(shù)投票法對(duì)同源三聚體中的錯(cuò)誤測(cè)序的堿基進(jìn)行糾錯(cuò)。比如，同源三聚體AAA在測(cè)序后變成了AGA，那么就可以使用多數(shù)投票法將其投票為A。不同的同源三聚體均可以按照這樣的方式進(jìn)行一一糾錯(cuò)，最后形成一條連續(xù)的序列，” Sun補(bǔ)充說(shuō)。

該研究表明，在分析差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄本(DEGs和DETs)時(shí)，同源三聚體UMIs在減少假陽(yáng)性折疊富集方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)單體UMIs。這種增強(qiáng)對(duì)于DEGs或DETs的準(zhǔn)確識(shí)別和定量至關(guān)重要，特別是在批量測(cè)序方法中。此外，在單細(xì)胞測(cè)序中，通常需要廣泛的PCR擴(kuò)增，同源三聚體UMIs已被證明可以有效減輕PCR人工產(chǎn)物的影響，從而大大提高測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性。

“通過(guò)構(gòu)建同源核苷塊的UMIs，我們的目標(biāo)是提高短讀和長(zhǎng)讀測(cè)序的糾錯(cuò)能力，這是我們對(duì)提高測(cè)序技術(shù)應(yīng)用的承諾，”Cribbs說(shuō)。

意義深遠(yuǎn)

這項(xiàng)研究具有深遠(yuǎn)的意義。通過(guò)糾正UMIs中的PCR誤差，極大地提高了各種測(cè)序應(yīng)用中的分子定量準(zhǔn)確性。它是大量RNA、單細(xì)胞RNA和DNA測(cè)序研究人員的重要工具，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因表達(dá)和分子譜分析。增強(qiáng)的UMI糾錯(cuò)不僅減少了假陽(yáng)性的發(fā)生率，而且還提供了多種診斷應(yīng)用，特別是在需要對(duì)樣本進(jìn)行縱向分析的情況下。

Sun解釋說(shuō)：“UMI糾錯(cuò)是PCR糾錯(cuò)的其中一種方式。如果UMI糾錯(cuò)情況得到改善，那么PCR錯(cuò)誤的分子計(jì)數(shù)就會(huì)變好。這樣PCR擴(kuò)展的分子被錯(cuò)誤歸入原始待測(cè)分子的可能性就低，所以假陽(yáng)性就低。從而，分子表達(dá)量測(cè)準(zhǔn)了之后就會(huì)幫助后續(xù)的疾病診斷（判斷表達(dá)量是否異常等），并且可能會(huì)增加更多的診斷應(yīng)用的可能性（例如，疾病診斷中的假陰性問(wèn)題，使用測(cè)序錯(cuò)誤較少精度高的表達(dá)數(shù)據(jù)做鑒定會(huì)幫助排除出現(xiàn)假陰性的鑒定結(jié)果，可靠度高應(yīng)用存在的可能性就越高）。在縱向研究中，不同的樣本或是實(shí)驗(yàn)重復(fù)之間存在的差異有可能很大。普通的糾錯(cuò)方法在底/高錯(cuò)誤率的情況下魯棒性可能差異比較大。然而我們?cè)诓煌�的樣本或是�?shí)驗(yàn)重復(fù)中得到的魯棒性是比較強(qiáng)的，也證明了該方法在應(yīng)用階段的穩(wěn)定性。”

這篇論文目前是《Nature Methods》有數(shù)據(jù)追蹤以來(lái)與同期發(fā)表文章相比最受歡迎的文章，排名第1，而且在所有期刊當(dāng)中發(fā)表的同期可追蹤的202,746篇文章中網(wǎng)絡(luò)熱度位居1962名（詳情請(qǐng)看https://www.nature.com/articles/s41592-024-02168-y/metrics）。

同時(shí)該文章也吸引了各媒體的報(bào)道，牛津大學(xué)也詳細(xì)報(bào)道了這項(xiàng)研究：

https://www.ox.ac.uk/news/2024-02-08-new-research-improves-accuracy-molecular-quantification-high-throughput-sequencin

原文標(biāo)題：

Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules

作者簡(jiǎn)介：

Jianfeng Sun

POSTDOCTORAL RESEARCH ASSOCIATE IN SINGLE-CELL SEQUENCING ANALYSIS

I obtained my Ph.D. (Nov. 2017 - Feb. 2021) in deep learning-based structural biology from the Technical University of Munich, Germany. Since Jul. 2021, I have been a postdoctoral researcher in Prof. Cribbs' lab in NDORMS at the University of Oxford. My main responsibility is the improvement of long-read sequencing accuracy with computational approaches as well as the analysis of single-cell sequencing data. Besides, my other research interests are systems biology and structural biology. I am fascinated by deciphering intricate biological networks by capitalizing on computational modeling algorithms, which show promise to illuminate the mechanisms of biomolecules.