免疫組庫(kù)（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定時(shí)間，個(gè)體的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)所有功能多樣性B細(xì)胞和T細(xì)胞的總和。

T細(xì)胞是獲得性免疫反應(yīng)的重要組成部分，其表面受體蛋白（T cell receptors, TCRs）發(fā)揮著識(shí)別抗原分子的作用。NGS是解析TCR多樣性的主流技術(shù)，對(duì)揭示個(gè)體獲得性免疫反應(yīng)的奧秘提供了寶貴的技術(shù)支撐。

SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)是一款具有高靈敏度和低偏差的小鼠TCR NGS文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。該試劑盒整合SMART（Switching Mechanism at 5' end of RNA Template）全長(zhǎng)cDNA合成技術(shù)與5’RACE技術(shù)，可捕獲TRA和TRB基因完整的V(D)J可變區(qū)，用于后續(xù)NGS分析。

該試劑盒支持使用不同input量的RNA（RIN＞7）或細(xì)胞起始，均可獲得高品質(zhì)的測(cè)序文庫(kù)，如小鼠脾臟或T細(xì)胞來(lái)源 total RNA(1 ng-1 μg)，以及全血、骨髓、胸腺來(lái)源total RNA(10 ng -1 ug)，或純化后完整的T細(xì)胞(1,000-10,000個(gè))。文庫(kù)中可同時(shí)包含α鏈和β鏈的多樣性信息。

同時(shí)，該試劑盒包含UMI（Unique Molecular Identifier），用以去除PCR偏差及測(cè)序錯(cuò)誤所產(chǎn)生的reads，提供更正確和可靠的結(jié)果。

搭配使用UDI（Unique Dual Indexs），最多可支持384個(gè)樣本同時(shí)測(cè)序。

特別開(kāi)發(fā)的Cogent NGS Immune Profiler Software (Cogent IP)，能直接對(duì)Illumina測(cè)序儀的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行高品質(zhì)的TCR profiling分析，包括克隆型的鑒定與計(jì)數(shù)、V(D)J區(qū)域的序列分析。另外，基于云的Cogent NGS Immune Viewer，能可視化的展示TCR數(shù)據(jù)，使用Cogent IP輸出文件，可以輕松生成可供發(fā)布的圖表結(jié)果。

下面就詳細(xì)了解一下它的特點(diǎn)吧！

圖1 SMART-Seq Mouse TCR(with UMIs)技術(shù)流程

圖2 評(píng)估試劑盒在不同樣本起始量和樣本類型中的性能表現(xiàn) 

Panel A. 分別對(duì)10，100，250，500和1,000 ng小鼠脾臟來(lái)源 RNA使用SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)制備了TRA (藍(lán)色) 和TRB (紫色) 文庫(kù)，然后在Illumina NextSeq測(cè)序（PE 150），測(cè)序reads downsampled至1.5×10⁷。結(jié)果顯示，隨著起始量的增加，檢測(cè)到的克隆型數(shù)量也隨之增加。

Panel B. 分別對(duì)四種不同樣品類型的小鼠RNA（200 ng RNA）使用SMART-Seq Mouse TCR制備文庫(kù)。然后在Illumina NextSeq測(cè)序（PE 150），測(cè)序reads downsampled至2.5×10⁷。測(cè)序結(jié)果表明，TCR序列在這些樣品類型中都被靈敏地檢測(cè)到，這表明該試劑盒非常適合用于小鼠TCR的分析。

圖3 使用UMIs校正PCR重復(fù)和測(cè)序錯(cuò)誤

Panel A. 對(duì)10 ng小鼠脾臟來(lái)源 RNA使用SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)制備TRA和TRB文庫(kù)。其中藍(lán)線和紫線分別是指經(jīng)過(guò)UMI修正誤差和和沒(méi)有經(jīng)過(guò)UMI修正誤差的數(shù)據(jù)。

Panel B. 為了評(píng)估SMART-Seq Mouse TCR (with UMIs)的再現(xiàn)性，使用該試劑盒分別對(duì)10 ng和100 ng小鼠脾RNA起始樣本構(gòu)建TCR文庫(kù)。然后在Illumina MiSeq測(cè)序。維恩圖顯示分別使用300 cycles和600 cycles測(cè)序時(shí)，兩者之間至少有87%的克隆型重疊，表明該試劑盒卓越的再現(xiàn)性。

圖4 評(píng)估試劑盒的測(cè)序靈活性 

為了評(píng)估該試劑盒是否支持全長(zhǎng)V (D) J或CDR3序列，使用該試劑盒分別對(duì)10 ng和100 ng小鼠脾臟RNA起始樣本構(gòu)建TCR文庫(kù)。然后在Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)使用300 cycles和600 cycles進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序read downsampled 至1×10⁶。使用Takara Bio Cogent NGS Immune Profiler軟件處理數(shù)據(jù)。