過去十年中，單細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)讓研究人員能夠深入探究和回答那些與人類健康和疾病息息相關(guān)的生物系統(tǒng)的更復(fù)雜問題。自從單細(xì)胞技術(shù)在2009年首次亮相以來(1,2)，科學(xué)家在免疫學(xué)(3,4)、癌癥(5,6)、神經(jīng)科學(xué)(7,8)等研究領(lǐng)域充分利用單細(xì)胞RNA測序，并發(fā)現(xiàn)了大量信息。單細(xì)胞測序的魅力和潛力在于能夠以足夠高的分辨率觀察生物學(xué)，從而區(qū)分稀有細(xì)胞類型、發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞類型，并解析隱藏的異質(zhì)性。

但是，若問題的答案包含在那些因采樣時間或地點(diǎn)限制而無法獲取的細(xì)胞時，您會怎么做？若您能夠克服樣本處理的物流挑戰(zhàn)而獲得新的生物學(xué)見解，那將會怎樣？在我們最近舉辦的Xperience 2022活動中，我們很高興與您分享了Chromium單細(xì)胞基因表達(dá)Flex分析的更多細(xì)節(jié)，這款新產(chǎn)品能夠解決上述問題，將樣本固定帶到高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，擴(kuò)大樣本可用性。

樣本固定對單細(xì)胞研究的好處

單細(xì)胞RNA測序研究的范圍和規(guī)模在不斷擴(kuò)大，研究人員的目標(biāo)是分析與患者隊(duì)列或多個治療條件或時間點(diǎn)相對應(yīng)的大量樣本。伴隨著這些實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，在樣本采集和處理方面還有一些額外因素需要考慮。基因表達(dá)Flex分析為高通量的批量分析創(chuàng)造了新的可能性，并將實(shí)驗(yàn)范圍擴(kuò)展到脆弱或?yàn)l死細(xì)胞、多個采集點(diǎn)的樣本，以及細(xì)胞狀態(tài)可能不斷變化的樣本。對于研究人員在嘗試達(dá)到新的研究深度時所面臨的眾多挑戰(zhàn)，這種新方法提供了解決方案。

“對于一些需要長距離運(yùn)輸樣本的項(xiàng)目，細(xì)胞或組織可能會因?yàn)檫\(yùn)輸過程中的物理撞擊或不適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件而失去活力。在某些情況下，人們需要保存樣本來實(shí)現(xiàn)更靈活的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；具體而言，它有助于保存在不同實(shí)驗(yàn)條件下或不同時間點(diǎn)采集的樣本，并將它們合并。此外，研究人員可能對特定生物學(xué)狀態(tài)感興趣，而體外處理可能激活特定通路，導(dǎo)致某些組織中的狀態(tài)發(fā)生改變。”(9)

保留脆弱細(xì)胞或動態(tài)的生物學(xué)狀態(tài)

在采集點(diǎn)固定樣本后，我們可通過標(biāo)準(zhǔn)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)來鎖定仍難以捉摸的生物學(xué)。其他存儲方法可能對脆弱細(xì)胞來說效果不佳，而反復(fù)凍融等常規(guī)方法可能造成細(xì)胞損傷。除了存儲，運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理也是對樣本完整性的潛在威脅。由此造成的某些細(xì)胞類型丟失或者死亡或?yàn)l死細(xì)胞的增加可能會扭曲您的分析結(jié)果，從而隱藏樣本的真正異質(zhì)性。同樣地，涉及到快速變化樣本的研究（比如短時間點(diǎn)的藥物篩選，刺激免疫細(xì)胞等）也將受益于高效固定，這種操作可保留動態(tài)細(xì)胞狀態(tài)，讓處理不再緊迫。

將分析擴(kuò)展到更多樣本

您研究的規(guī)模和整體情況可能很適合基因表達(dá)Flex分析。在大型實(shí)驗(yàn)中，您可能需要在多個時間點(diǎn)采集或在多個條件下檢測以開展小鼠、細(xì)胞系或類器官研究，如果實(shí)驗(yàn)方案要求您一次處理所有樣本，那么這些實(shí)驗(yàn)將難以承受，且耗費(fèi)體力。在采集細(xì)胞時對其進(jìn)行固定可以減輕這些大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的壓力，讓您在方便時處理樣本。或許您正在開展一項(xiàng)研究，其中樣本來自不同地區(qū)，需要運(yùn)輸?shù)街行膶?shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。固定能夠鎖定細(xì)胞狀態(tài)并保留樣本質(zhì)量以便存儲和運(yùn)輸，在不影響完整性的前提下將分析擴(kuò)展到更多樣本。

適應(yīng)日常的操作

您的實(shí)驗(yàn)室每天是如何運(yùn)作的？如果您與核心實(shí)驗(yàn)室或中心機(jī)構(gòu)合作，他們的工作時間可能有限，這就限制了接受新鮮樣本的時間。當(dāng)您的樣本在無法預(yù)測的時間采集時，這尤其重要。另一方面，即使是在您自己的實(shí)驗(yàn)室中處理，您也可能會擔(dān)心不同用戶或不同時間的一致性。在使用固定RNA-seq后，您可以存儲樣本在單次運(yùn)行中進(jìn)行批量處理，從而最大限度地減少變化。

消除安全顧慮

拋開這些圍繞通量以及樣本管理和細(xì)胞活力的操作問題，基因表達(dá)Flex分析甚至能夠提高研究人員的安全性。如果您的工作涉及到含有感染原或病原體的樣本，那么需要在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室中執(zhí)行單細(xì)胞研究的所有操作，這會很不方便。固定能夠消除感染原，為您的實(shí)驗(yàn)室工作帶來更多自由。

熟悉且易用的流程

Chromium單細(xì)胞基因表達(dá)Flex分析采用多聚甲醛（PFA）固定，在采集點(diǎn)保留樣本的生物學(xué)特性，這能夠簡化工作流程，將分析擴(kuò)展到更多樣本，而不受時間限制。我們用值得信賴的Next GEM技術(shù)開發(fā)出一種操作方案，過去用過我們Chromium單細(xì)胞基因表達(dá)分析的用戶都會很熟悉，即使是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)新手也很容易上手。

這個強(qiáng)大的工作流程包括經(jīng)過優(yōu)化的示范方案，適合不同樣本類型，包括細(xì)胞系、原代細(xì)胞、含有脆弱細(xì)胞的解離組織、新鮮或冷凍組織以及FFPE組織。

如上文所述，細(xì)胞或細(xì)胞核在采集點(diǎn)固定和透化后，就可以安全地存儲和運(yùn)輸，而不會影響樣本完整性或下游數(shù)據(jù)質(zhì)量。在方便時將樣本與探針組（覆蓋18,000多個基因）雜交，并使用單個樣本流程進(jìn)行單獨(dú)處理，或者使用混樣分析流程在Chromium芯片的單個通道中合并處理多達(dá)16個樣本。

這一步的分析流程與我們的3’和5’基因表達(dá)方案高度相似，需要在Chromium iX/X儀器上進(jìn)行單細(xì)胞微滴生成。在此過程中，連接探針組并延伸以加入獨(dú)特的條形碼，從而保留細(xì)胞身份。在構(gòu)建文庫和測序之后，可以使用10x Genomics的Cell Ranger和Loupe Browser軟件工具進(jìn)行分析。

Chromium單細(xì)胞基因表達(dá)Flex分析流程概覽

固定，還是不固定？

與任何新研究一樣，您需要充分考慮您的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)以及這些目標(biāo)如何影響整體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，更重要的是，哪些分析可幫助您達(dá)成這些目標(biāo)。對于單細(xì)胞基因表達(dá)研究，樣本類型、通量能力和特定分析物都會影響這一決策。

物種

單細(xì)胞基因表達(dá)Flex分析目前與人類和小鼠樣本兼容。對于其他物種，經(jīng)典的3’或5’單細(xì)胞基因表達(dá)分析將是最佳選擇。

通量

如果您正在處理大量樣本，并希望對它們進(jìn)行批量分析或混樣分析，現(xiàn)在有兩個選擇：基因表達(dá)Flex分析或單細(xì)胞基因表達(dá)HT（帶有3’ CellPlex混樣分析）。基因表達(dá)Flex分析通過內(nèi)置在探針組中的獨(dú)特條形碼實(shí)現(xiàn)混樣分析，而帶有3’ CellPlex的單細(xì)胞基因表達(dá)HT分析使用與物種無關(guān)的標(biāo)簽來標(biāo)記樣本。同樣，在鑒定稀有細(xì)胞或深度開發(fā)細(xì)胞圖譜時，這兩種分析方法都能幫助您最大限度地提高特定樣本的細(xì)胞通量。

分析物

多組學(xué)分析能夠?yàn)閱渭?xì)胞實(shí)驗(yàn)增添驚人的細(xì)節(jié)，而我們的每種單細(xì)胞基因表達(dá)分析都提供了同時測定多個分析物的選項(xiàng)。使用單細(xì)胞基因表達(dá)試劑盒或基因表達(dá)Flex分析的單個樣本流程可分析全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)和細(xì)胞表面蛋白表達(dá)。（在我們的兼容產(chǎn)品頁面上查找BioLegend的TotalSeq B寡核苷酸偶聯(lián)抗體，了解抗體組合的更多信息。）

如果您想獲得其他的多組學(xué)信息，下列分析為您提供了探索更多分析物的絕佳機(jī)會，但與PFA樣本不兼容。在深入研究免疫學(xué)問題時，單細(xì)胞免疫分析能夠分析配對的全長B細(xì)胞或T細(xì)胞受體、表面蛋白表達(dá)、抗原特異性和基因表達(dá)，所有這些都來自同一個單細(xì)胞。我們的單細(xì)胞CRISPR篩選分析可幫助您直接評估特定的基因編輯或敲低，以及由此產(chǎn)生的基因表達(dá)譜（很快還有細(xì)胞表面蛋白）。

創(chuàng)新的工具，全新的見解

隨著研究不斷向前推進(jìn)以改善人類健康，我們看到新的機(jī)會不斷出現(xiàn)，有望克服更大型、更復(fù)雜研究的挑戰(zhàn)。基因表達(dá)Flex分析的開發(fā)是為了將研究擴(kuò)大到更多樣本，保留脆弱細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)，并克服阻礙此類研究取得進(jìn)展的物流挑戰(zhàn)。隨著單細(xì)胞技術(shù)有了這些重大進(jìn)步，科學(xué)家們能夠研究影響生理學(xué)和病理學(xué)的分子變化，讓我們對疾病進(jìn)展和治療的認(rèn)知有所改變。

更多信息請參考Chromium單細(xì)胞基因表達(dá)Flex彩頁

參考文獻(xiàn)：

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