自從1977年Sanger發(fā)明DNA雙脫氧鏈終止法測序技術(shù)以來，各種測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，人類對于基因?qū)用娴难芯恳苍絹碓缴钊搿�從以Sanger測序為代表的一代測序技術(shù)到以基于光學(xué)檢測的Illumina測序為代表的二代測序技術(shù)（NGS）到以PacBio為代表的三代單分子測序技術(shù)，越來越多的測序技術(shù)應(yīng)用在了人類等基因研究中。今天要給大家介紹的是基因有限公司全國代理的剛誕生就引發(fā)業(yè)界關(guān)注與期待的一匹NGS黑馬:美國GenapSys的基于合成的數(shù)字化電信號測序技術(shù)（electronic sequencing by synthesis )，全新原理、高通量、高準(zhǔn)確度、低成本的NGS技術(shù)。

1 技術(shù)原理

圖1 Genapsys基于合成的電子測序（Electronic Sequencing bySynthesis）技術(shù)原理
（GenapSys的測序原理是根據(jù)檢測到電阻抗變化信號來確定基因序列信息，該變化是由核苷酸摻入與球珠結(jié)合的DNA中引起的。由于核苷酸摻入會增加珠子周圍的帶電分子數(shù)量，進(jìn)而會改變芯片中傳感器測量到的阻抗，阻抗變化的大小與DNA分子及其周圍電荷的總變化有關(guān)，即與結(jié)合核苷酸的數(shù)目有關(guān)。）

目前NGS平臺從檢測原理上可以簡單分為光學(xué)檢測和電信號變化檢測兩種技術(shù)。而我們今天要介紹的GenapSys測序技術(shù)區(qū)別于這兩種瞬時檢測技術(shù)，GenapSys測序技術(shù)是基于穩(wěn)態(tài)檢測的方式，通過檢測模板鏈上的阻抗變化來獲得相應(yīng)的堿基信息（如圖1）。

圖1 與其他NGS測序技術(shù)原理對比
（對比光學(xué)檢測（右）及基于pH變化的檢測模式（中），GenapSys的檢測技術(shù)（左）在每次檢測電信號變化前有一段基線穩(wěn)定狀態(tài)，檢測信息讀取靈敏度和精度能達(dá)到更高的水平）

區(qū)別于光學(xué)檢測方式和電化學(xué)檢測方式，GenapSys的電子信號檢測是基于芯片中傳感器檢測每個堿基摻入后的電阻變化，從而確定相應(yīng)的堿基信息。且在檢測新?lián)饺氲膲A基信號前都有相應(yīng)的平臺期（穩(wěn)態(tài)期），這樣一來就可以更加準(zhǔn)確的定位每種堿基的信號值。

并且基于這種穩(wěn)態(tài)特性，如果需要可以對同一摻入堿基進(jìn)行多次檢測，來增加測序的精度和信噪比(SNR)，另外傳感器之間并不存在信號干擾和串信號的問題，這大大提高base calling精度。

2 測序結(jié)果表現(xiàn)

當(dāng)然對比測序原理和技術(shù)特點(diǎn)來說，大家更看重的是測序結(jié)果的具體表現(xiàn)怎樣，NGS測序結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)主要是對reads進(jìn)行評估，包括如reads的數(shù)量，準(zhǔn)確度，覆蓋度等。那GenapSys的表現(xiàn)如何呢，以已有的16M（Million）傳感器芯片為例，GenapSys單次運(yùn)行可以獲得11-13M的平均長度為150bp的reads,并且Raw read 準(zhǔn)確度可以達(dá)到 >99.98%，在另一個質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Q30的數(shù)值上，GenapSys可以達(dá)到>80%的堿基分值>Q30(99.9%)。

圖2 GenapSys測序數(shù)據(jù)表現(xiàn)
（以16M芯片為例，通常會產(chǎn)出11-13M有效的高質(zhì)量reads(>80%的堿基分值>Q30)，讀取平均長度約為150bp。）

不僅是在堿基準(zhǔn)確率上，GenapSys達(dá)到了行業(yè)的領(lǐng)先水平，在評估測序數(shù)據(jù)的另外一個標(biāo)準(zhǔn)覆蓋度上，GenapSys也有著很好的表現(xiàn)，從對比NGS行業(yè)主流平臺的結(jié)果來看，在基因組覆蓋度和在不同GC含量區(qū)域的準(zhǔn)確度和覆蓋度上，GenapSys都達(dá)到了很高的水平。

圖3 GenapSys測序在微生物基因組覆蓋度表現(xiàn)
（使用大腸桿菌作為測試樣本進(jìn)行測序，在平均測序深度150X的情況下，完整覆蓋了大腸桿菌4.7Mb基因組，并且raw read準(zhǔn)確率達(dá)到了Q30以上）

圖4 GenapSys測序在不同GC含量基因組表現(xiàn)
（對比與其他NGS主流測序技術(shù)空腸彎曲桿菌(low GC)和雙歧桿菌（high GC)測序結(jié)果，GenapSys不同GC含量的基因組覆蓋度上表現(xiàn)優(yōu)秀。）

而從另一個評估標(biāo)準(zhǔn)堿基錯配率(mismatch rate)來看，在reads的前150bp，GenapSys表現(xiàn)出了比主流測序平臺更好的結(jié)果，后續(xù)GenapSys也會繼續(xù)更新相應(yīng)的試劑和芯片，提高測序讀長，達(dá)到更高的通量來滿足各種需求。

圖5 對比主流測序平臺mismatch rate
（在mismatch rate對比上，在read的前150bp,GenapSys表現(xiàn)出了遠(yuǎn)優(yōu)于其他NGS測序技術(shù)的準(zhǔn)確度。其他NGS測序技術(shù)準(zhǔn)確率一般維持在99.9%水平（黃色），而GenapSys遠(yuǎn)高于此（藍(lán)色）。）

3 應(yīng)用表現(xiàn)

從具體應(yīng)用來看，GenapSys的表現(xiàn)同樣達(dá)到了行業(yè)的領(lǐng)先水平。比如NGS領(lǐng)域*常見的應(yīng)用SNP分析（NA12878外顯子組測序為例），對比主流平臺，不管是準(zhǔn)確度還是發(fā)現(xiàn)的SNP數(shù)量上，GenapSys都有著優(yōu)良的表現(xiàn)，特別是在低覆蓋度情況下，GenapSys的SNP檢出比其他主流測序平臺有更高的準(zhǔn)確性。

圖6 NA12878外顯子組測序表現(xiàn)
（在read的前100bp，GenapSys表現(xiàn)出優(yōu)異的準(zhǔn)確度；并且GenapSys在測序深度僅有66X的情況下對SNP的檢出數(shù)量達(dá)到了與其他NGS測序技術(shù)200X深度相同的水平。）

圖7 對比主流測序平臺SNP鑒定表現(xiàn)
（對比其他測序平臺，GenapSys數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性更高，特別是在覆蓋率較低的情況下，可以顯著降低錯配誤差。）

在具體應(yīng)用上，當(dāng)然不僅SNP檢測上，其他的應(yīng)用如罕見突變鑒定（圖8）、供體cfDNA水平檢測（圖10）、RNA-seq等應(yīng)用上，對比主流測序平臺，GenapSys同樣有著優(yōu)異的表現(xiàn)。

圖8 Horizon Discovery HD701測序calling精度
（對于罕見突變的檢出精度，達(dá)到甚至超過主流測序平臺）

圖9 外顯子同聚物測序表現(xiàn)
（對于同聚物堿基測序變現(xiàn)與主流平臺接近，優(yōu)于電化學(xué)檢測技術(shù)）

圖10 dd-cfDNA測序表現(xiàn)
（當(dāng)移植器官被排斥時，供體來源的cfDNA水平會飆升。正常的、被接受的器官和主動排斥反應(yīng)之間的差異只有0.1%-1%。因此這種檢測需要非常高的靈敏度，通過2個對照組和2個移植病人的結(jié)果，GenapSys能夠重現(xiàn)性地識別預(yù)期的供體來源水平，并成功地區(qū)分主動排斥和非主動排斥。）

4 文庫制備

GenapSys不僅提供高質(zhì)量的測序平臺，在測序文庫準(zhǔn)備上同樣有著簡單化、自動化的解決方案，從建庫角度來看，GenapSys不僅有著與主流平臺通用的樣品前處理過程，兼容多種建庫試劑盒，并且在獨(dú)特的擴(kuò)增克隆步驟上提供了自動化的解決方案，相比手工操作繁瑣的步驟，GenapSys建庫儀只需要簡單幾分鐘操作就可以實(shí)現(xiàn)4小時以上的無人值守狀態(tài)下的克隆擴(kuò)增等建庫過程。

圖11 GenapSys測序流程及文庫準(zhǔn)備系統(tǒng)
（對比需要將近兩小時的手工建庫擴(kuò)增過程，GenapSys自動建庫系統(tǒng)只需要簡單幾分鐘手動操作就可以實(shí)現(xiàn)4小時以上的無人值守狀態(tài)下的克隆擴(kuò)增等建庫過程。）

5 應(yīng)用和成本

具體應(yīng)用上，根據(jù)不同應(yīng)用對于數(shù)據(jù)量的需求，GenapSys提供了不同通量的芯片來適配不同的應(yīng)用，在不同通量需求的應(yīng)用間切換時只需要根據(jù)不同的需求選擇相應(yīng)的芯片（144M芯片將于2020年上市），而無需更換測序儀器。

圖12 不同應(yīng)用對應(yīng)適用芯片情況
（可根據(jù)應(yīng)用需求進(jìn)行選擇，無需改變底層設(shè)備，144M芯片將于2020上市）

圖13 不同傳感器數(shù)量芯片
（1M芯片大約產(chǎn)出0.2Gb/run,16M芯片產(chǎn)出約2Gb/run,144M芯片預(yù)計產(chǎn)出約15Gb/run（SE,150bp）。）

而在大家*關(guān)心的價格部分，GenapSys在保證測序結(jié)果高質(zhì)量的前提下，帶來了難以置信的價格，不僅是儀器的超低價格，在運(yùn)行成本上同樣有著非常大的優(yōu)勢。

當(dāng)然如果您有高通量及數(shù)據(jù)量大的需求，基于GenapSys 單臺測序儀本身低價，以現(xiàn)有16M芯片產(chǎn)出為例（1.5-2Gb/run），通過組合一臺以上測序儀（一臺以上測序儀➕1臺克隆擴(kuò)增儀），在同等時間內(nèi)獲得比其他主流平臺更高通量及更高數(shù)據(jù)量。而在今年144M芯片上市以后，可無需更換儀器而獲得比其他主流平臺更高的通量及數(shù)據(jù)量。（144M芯片預(yù)計可產(chǎn)出約15Gb/run）。

圖14 成本核算（24h產(chǎn)出約65M reads）
（以現(xiàn)有16M芯片，單次運(yùn)行可產(chǎn)出13M高質(zhì)量 reads）

金杯銀杯不如客戶的口碑，那么使用過GenapSys測序儀的科學(xué)家會如何評價這款測序儀呢，請看下方！！！

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