自從1977年Sanger發(fā)明DNA雙脫氧鏈終止法測(cè)序技術(shù)以來(lái)，各種測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，人類對(duì)于基因?qū)用娴难芯恳苍絹?lái)越深入。從以Sanger測(cè)序?yàn)榇�表的一代測(cè)序技術(shù)到以基于光學(xué)檢測(cè)的Illumina測(cè)序?yàn)榇�表的二代測(cè)序技術(shù)（NGS）到以PacBio為代表的三代單分子測(cè)序技術(shù)，越來(lái)越多的測(cè)序技術(shù)應(yīng)用在了人類等基因研究中。今天要給大家介紹的是基因有限公司全國(guó)代理的剛誕生就引發(fā)業(yè)界關(guān)注與期待的一匹NGS黑馬:美國(guó)GenapSys的基于合成的數(shù)字化電信號(hào)測(cè)序技術(shù)（electronic sequencing by synthesis )，全新原理、高通量、高準(zhǔn)確度、低成本的NGS技術(shù)。

1 技術(shù)原理

圖1 Genapsys基于合成的電子測(cè)序（Electronic Sequencing bySynthesis）技術(shù)原理
（GenapSys的測(cè)序原理是根據(jù)檢測(cè)到電阻抗變化信號(hào)來(lái)確定基因序列信息，該變化是由核苷酸摻入與球珠結(jié)合的DNA中引起的。由于核苷酸摻入會(huì)增加珠子周圍的帶電分子數(shù)量，進(jìn)而會(huì)改變芯片中傳感器測(cè)量到的阻抗，阻抗變化的大小與DNA分子及其周圍電荷的總變化有關(guān)，即與結(jié)合核苷酸的數(shù)目有關(guān)。）

目前NGS平臺(tái)從檢測(cè)原理上可以簡(jiǎn)單分為光學(xué)檢測(cè)和電信號(hào)變化檢測(cè)兩種技術(shù)。而我們今天要介紹的GenapSys測(cè)序技術(shù)區(qū)別于這兩種瞬時(shí)檢測(cè)技術(shù)，GenapSys測(cè)序技術(shù)是基于穩(wěn)態(tài)檢測(cè)的方式，通過(guò)檢測(cè)模板鏈上的阻抗變化來(lái)獲得相應(yīng)的堿基信息（如圖1）。

圖1 與其他NGS測(cè)序技術(shù)原理對(duì)比
（對(duì)比光學(xué)檢測(cè)（右）及基于pH變化的檢測(cè)模式（中），GenapSys的檢測(cè)技術(shù)（左）在每次檢測(cè)電信號(hào)變化前有一段基線穩(wěn)定狀態(tài)，檢測(cè)信息讀取靈敏度和精度能達(dá)到更高的水平）

區(qū)別于光學(xué)檢測(cè)方式和電化學(xué)檢測(cè)方式，GenapSys的電子信號(hào)檢測(cè)是基于芯片中傳感器檢測(cè)每個(gè)堿基摻入后的電阻變化，從而確定相應(yīng)的堿基信息。且在檢測(cè)新?lián)饺氲膲A基信號(hào)前都有相應(yīng)的平臺(tái)期（穩(wěn)態(tài)期），這樣一來(lái)就可以更加準(zhǔn)確的定位每種堿基的信號(hào)值。

并且基于這種穩(wěn)態(tài)特性，如果需要可以對(duì)同一摻入堿基進(jìn)行多次檢測(cè)，來(lái)增加測(cè)序的精度和信噪比(SNR)，另外傳感器之間并不存在信號(hào)干擾和串信號(hào)的問(wèn)題，這大大提高base calling精度。

2 測(cè)序結(jié)果表現(xiàn)

當(dāng)然對(duì)比測(cè)序原理和技術(shù)特點(diǎn)來(lái)說(shuō)，大家更看重的是測(cè)序結(jié)果的具體表現(xiàn)怎樣，NGS測(cè)序結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)主要是對(duì)reads進(jìn)行評(píng)估，包括如reads的數(shù)量，準(zhǔn)確度，覆蓋度等。那GenapSys的表現(xiàn)如何呢，以已有的16M（Million）傳感器芯片為例，GenapSys單次運(yùn)行可以獲得11-13M的平均長(zhǎng)度為150bp的reads,并且Raw read 準(zhǔn)確度可以達(dá)到 >99.98%，在另一個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Q30的數(shù)值上，GenapSys可以達(dá)到>80%的堿基分值>Q30(99.9%)。

圖2 GenapSys測(cè)序數(shù)據(jù)表現(xiàn)
（以16M芯片為例，通常會(huì)產(chǎn)出11-13M有效的高質(zhì)量reads(>80%的堿基分值>Q30)，讀取平均長(zhǎng)度約為150bp。）

不僅是在堿基準(zhǔn)確率上，GenapSys達(dá)到了行業(yè)的領(lǐng)先水平，在評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的另外一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)覆蓋度上，GenapSys也有著很好的表現(xiàn)，從對(duì)比NGS行業(yè)主流平臺(tái)的結(jié)果來(lái)看，在基因組覆蓋度和在不同GC含量區(qū)域的準(zhǔn)確度和覆蓋度上，GenapSys都達(dá)到了很高的水平。

圖3 GenapSys測(cè)序在微生物基因組覆蓋度表現(xiàn)
（使用大腸桿菌作為測(cè)試樣本進(jìn)行測(cè)序，在平均測(cè)序深度150X的情況下，完整覆蓋了大腸桿菌4.7Mb基因組，并且raw read準(zhǔn)確率達(dá)到了Q30以上）

圖4 GenapSys測(cè)序在不同GC含量基因組表現(xiàn)
（對(duì)比與其他NGS主流測(cè)序技術(shù)空腸彎曲桿菌(low GC)和雙歧桿菌（high GC)測(cè)序結(jié)果，GenapSys不同GC含量的基因組覆蓋度上表現(xiàn)優(yōu)秀。）

而從另一個(gè)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)堿基錯(cuò)配率(mismatch rate)來(lái)看，在reads的前150bp，GenapSys表現(xiàn)出了比主流測(cè)序平臺(tái)更好的結(jié)果，后續(xù)GenapSys也會(huì)繼續(xù)更新相應(yīng)的試劑和芯片，提高測(cè)序讀長(zhǎng)，達(dá)到更高的通量來(lái)滿足各種需求。

圖5 對(duì)比主流測(cè)序平臺(tái)mismatch rate
（在mismatch rate對(duì)比上，在read的前150bp,GenapSys表現(xiàn)出了遠(yuǎn)優(yōu)于其他NGS測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確度。其他NGS測(cè)序技術(shù)準(zhǔn)確率一般維持在99.9%水平（黃色），而GenapSys遠(yuǎn)高于此（藍(lán)色）。）

3 應(yīng)用表現(xiàn)

從具體應(yīng)用來(lái)看，GenapSys的表現(xiàn)同樣達(dá)到了行業(yè)的領(lǐng)先水平。比如NGS領(lǐng)域*常見的應(yīng)用SNP分析（NA12878外顯子組測(cè)序?yàn)槔�），�?duì)比主流平臺(tái)，不管是準(zhǔn)確度還是發(fā)現(xiàn)的SNP數(shù)量上，GenapSys都有著優(yōu)良的表現(xiàn)，特別是在低覆蓋度情況下，GenapSys的SNP檢出比其他主流測(cè)序平臺(tái)有更高的準(zhǔn)確性。

圖6 NA12878外顯子組測(cè)序表現(xiàn)
（在read的前100bp，GenapSys表現(xiàn)出優(yōu)異的準(zhǔn)確度；并且GenapSys在測(cè)序深度僅有66X的情況下對(duì)SNP的檢出數(shù)量達(dá)到了與其他NGS測(cè)序技術(shù)200X深度相同的水平。）

圖7 對(duì)比主流測(cè)序平臺(tái)SNP鑒定表現(xiàn)
（對(duì)比其他測(cè)序平臺(tái)，GenapSys數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性更高，特別是在覆蓋率較低的情況下，可以顯著降低錯(cuò)配誤差。）

在具體應(yīng)用上，當(dāng)然不僅SNP檢測(cè)上，其他的應(yīng)用如罕見突變鑒定（圖8）、供體cfDNA水平檢測(cè)（圖10）、RNA-seq等應(yīng)用上，對(duì)比主流測(cè)序平臺(tái)，GenapSys同樣有著優(yōu)異的表現(xiàn)。

圖8 Horizon Discovery HD701測(cè)序calling精度
（對(duì)于罕見突變的檢出精度，達(dá)到甚至超過(guò)主流測(cè)序平臺(tái)）

圖9 外顯子同聚物測(cè)序表現(xiàn)
（對(duì)于同聚物堿基測(cè)序變現(xiàn)與主流平臺(tái)接近，優(yōu)于電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)）

圖10 dd-cfDNA測(cè)序表現(xiàn)
（當(dāng)移植器官被排斥時(shí)，供體來(lái)源的cfDNA水平會(huì)飆升。正常的、被接受的器官和主動(dòng)排斥反應(yīng)之間的差異只有0.1%-1%。因此這種檢測(cè)需要非常高的靈敏度，通過(guò)2個(gè)對(duì)照組和2個(gè)移植病人的結(jié)果，GenapSys能夠重現(xiàn)性地識(shí)別預(yù)期的供體來(lái)源水平，并成功地區(qū)分主動(dòng)排斥和非主動(dòng)排斥。）

4 文庫(kù)制備

GenapSys不僅提供高質(zhì)量的測(cè)序平臺(tái)，在測(cè)序文庫(kù)準(zhǔn)備上同樣有著簡(jiǎn)單化、自動(dòng)化的解決方案，從建庫(kù)角度來(lái)看，GenapSys不僅有著與主流平臺(tái)通用的樣品前處理過(guò)程，兼容多種建庫(kù)試劑盒，并且在獨(dú)特的擴(kuò)增克隆步驟上提供了自動(dòng)化的解決方案，相比手工操作繁瑣的步驟，GenapSys建庫(kù)儀只需要簡(jiǎn)單幾分鐘操作就可以實(shí)現(xiàn)4小時(shí)以上的無(wú)人值守狀態(tài)下的克隆擴(kuò)增等建庫(kù)過(guò)程。

圖11 GenapSys測(cè)序流程及文庫(kù)準(zhǔn)備系統(tǒng)
（對(duì)比需要將近兩小時(shí)的手工建庫(kù)擴(kuò)增過(guò)程，GenapSys自動(dòng)建庫(kù)系統(tǒng)只需要簡(jiǎn)單幾分鐘手動(dòng)操作就可以實(shí)現(xiàn)4小時(shí)以上的無(wú)人值守狀態(tài)下的克隆擴(kuò)增等建庫(kù)過(guò)程。）

5 應(yīng)用和成本

具體應(yīng)用上，根據(jù)不同應(yīng)用對(duì)于數(shù)據(jù)量的需求，GenapSys提供了不同通量的芯片來(lái)適配不同的應(yīng)用，在不同通量需求的應(yīng)用間切換時(shí)只需要根據(jù)不同的需求選擇相應(yīng)的芯片（144M芯片將于2020年上市），而無(wú)需更換測(cè)序儀器。

圖12 不同應(yīng)用對(duì)應(yīng)適用芯片情況
（可根據(jù)應(yīng)用需求進(jìn)行選擇，無(wú)需改變底層設(shè)備，144M芯片將于2020上市）

圖13 不同傳感器數(shù)量芯片
（1M芯片大約產(chǎn)出0.2Gb/run,16M芯片產(chǎn)出約2Gb/run,144M芯片預(yù)計(jì)產(chǎn)出約15Gb/run（SE,150bp）。）

而在大家*關(guān)心的價(jià)格部分，GenapSys在保證測(cè)序結(jié)果高質(zhì)量的前提下，帶來(lái)了難以置信的價(jià)格，不僅是儀器的超低價(jià)格，在運(yùn)行成本上同樣有著非常大的優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)然如果您有高通量及數(shù)據(jù)量大的需求，基于GenapSys 單臺(tái)測(cè)序儀本身低價(jià)，以現(xiàn)有16M芯片產(chǎn)出為例（1.5-2Gb/run），通過(guò)組合一臺(tái)以上測(cè)序儀（一臺(tái)以上測(cè)序儀➕1臺(tái)克隆擴(kuò)增儀），在同等時(shí)間內(nèi)獲得比其他主流平臺(tái)更高通量及更高數(shù)據(jù)量。而在今年144M芯片上市以后，可無(wú)需更換儀器而獲得比其他主流平臺(tái)更高的通量及數(shù)據(jù)量。（144M芯片預(yù)計(jì)可產(chǎn)出約15Gb/run）。

圖14 成本核算（24h產(chǎn)出約65M reads）
（以現(xiàn)有16M芯片，單次運(yùn)行可產(chǎn)出13M高質(zhì)量 reads）

金杯銀杯不如客戶的口碑，那么使用過(guò)GenapSys測(cè)序儀的科學(xué)家會(huì)如何評(píng)價(jià)這款測(cè)序儀呢，請(qǐng)看下方！！！

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