中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院蘇士成教授、許小丁教授與中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院高志良教授合作，在非酒精性脂肪性肝炎領(lǐng)域發(fā)表了題為“Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output”的研究性論文。該論文應(yīng)用Arraystar Human CircRNA芯片篩選鑒定出與非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生相關(guān)的環(huán)狀RNA分子SCAR，功能研究表明，在線粒體中過(guò)表達(dá)circRNA SCAR會(huì)抑制肝臟成纖維細(xì)胞的活化并抑制相應(yīng)的炎癥反應(yīng)，敲低則有相反的表型。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，由脂質(zhì)暴露引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）會(huì)上調(diào)CHOP的表達(dá)，CHOP通過(guò)抑制PGC-1α的轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致線粒體中circRNA SCAR表達(dá)量的下降。circRNA SCAR表達(dá)量的下降使得原本與其結(jié)合的ATP5B轉(zhuǎn)而與CypD結(jié)合導(dǎo)致mPTP通道開(kāi)放。開(kāi)放的mPTP通道能夠使線粒體中的ROS釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而ROS作為一類活性氧物質(zhì)能夠增強(qiáng)肝臟成纖維細(xì)胞的促炎能力從而導(dǎo)致肝臟炎癥的加重�？傮w而言，該研究解決了非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展機(jī)制的重要問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)了線粒體circRNA的重要功能并發(fā)展了一系列相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)并指明了方向。該研究成果于2020年10月發(fā)表在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Cell (IF: 38.637)上。（芯片實(shí)驗(yàn)由康成生物丨數(shù)譜生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）屬于脂肪肝病的一種，相比于單純性肝脂肪變性，該病引發(fā)的肝損傷更加嚴(yán)重，患者易于出現(xiàn)肝纖維化并引發(fā)相關(guān)肝臟疾病如肝硬化甚至肝癌的產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道稱，非酒精性脂肪性肝炎的全球患病率大約在3%-5%。因此，對(duì)該病的研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類將線性RNA分子的3’端和5’端通過(guò)反向剪切共價(jià)連接形成的環(huán)狀RNA分子，可以由外顯子、內(nèi)含子或者同時(shí)包含這兩種序列的片段組成。與線性分子相比，這種環(huán)形的結(jié)構(gòu)可提高環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性。環(huán)狀RNA發(fā)揮功能主要有四種機(jī)制：1、環(huán)狀RNA可以通過(guò)吸附miRNA發(fā)揮ceRNA機(jī)制。2、環(huán)狀RNA可以結(jié)合特定的蛋白，調(diào)控靶蛋白的功能。3、某些環(huán)狀RNA具有潛在的翻譯能力，能夠產(chǎn)生具有活性的短肽。4、環(huán)狀RNA能夠結(jié)合DNA影響基因的表達(dá)。

技術(shù)路線

研究思路

1. CircRNA高通量篩選及臨床數(shù)據(jù)研究

為了研究影響非酒精性脂肪性肝炎（NASH）發(fā)生的具體機(jī)制，作者選取了四份NASH患者肝成纖維細(xì)胞樣本，通過(guò)與正常樣本進(jìn)行對(duì)比，采用Arraystar Human CircRNA芯片篩選了差異倍數(shù)大于2，P值小于0.05的指標(biāo)（圖1A）。由于ROS的主要來(lái)源是線粒體，故作者重點(diǎn)尋找了線粒體定位的環(huán)狀RNA，最終找到在NASH患者肝成纖維細(xì)胞線粒體中表達(dá)下調(diào)的環(huán)狀RNA分子SCAR（圖1B），并通過(guò)RNase R消化、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一點(diǎn)（圖1C）。進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)臨床數(shù)據(jù)的分析，結(jié)果表明肝成纖維細(xì)胞中環(huán)狀RNA分子SCAR的水平與其細(xì)胞內(nèi)ROS含量呈反比且和整體肝臟健康程度呈正相關(guān)關(guān)系（圖1D），表明SCAR確實(shí)可能與NASH的發(fā)生相關(guān)。

2. 功能研究

為了證實(shí)環(huán)狀RNA分子SCAR具有引發(fā)NASH的功能，作者在肝成纖維細(xì)胞線粒體中過(guò)表達(dá)了這一環(huán)狀RNA。通過(guò)ELISA等實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)SCAR后，肝成纖維細(xì)胞內(nèi)從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的ROS量明顯減少（圖2A），并且能夠抑制肝成纖維細(xì)胞的活化以及炎癥因子的釋放（圖2B、2C、2D）。此外，敲低該分子則有相反的表型。除了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外，作者在小鼠模型上通過(guò)免疫組化等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SCAR使肝部浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞減少（圖2E）。因此，SCAR確實(shí)具有抑制NASH的能力并具有潛在的治療價(jià)值。

3. 機(jī)制研究

進(jìn)一步的，針對(duì)SCAR引發(fā)NASH的下游機(jī)制這一問(wèn)題。首先作者通過(guò)RNA pull down與質(zhì)譜聯(lián)用的方式找到了SCAR的結(jié)合蛋白ATP5B并確定了它們間的結(jié)合區(qū)域（圖3A、3B）。已有文獻(xiàn)表明，ATP5B作為線粒體上mPTP通道的組成蛋白之一，可以影響該通道的開(kāi)放程度，因此作者利用IP等技術(shù)深入研究了SCAR對(duì)于mPTP通道的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：環(huán)狀RNA分子SCAR能夠阻礙CypD蛋白結(jié)合ATP5B，從而導(dǎo)致mPTP通道無(wú)法開(kāi)放（圖3C）。因此，在SCAR表達(dá)量減少的情況下，mPTP通道能夠被CypD結(jié)合并開(kāi)啟，從而使得線粒體內(nèi)的ROS釋放到細(xì)胞質(zhì)中（圖3D），進(jìn)而導(dǎo)致肝成纖維細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放減少（圖3E）。

最后，作者進(jìn)一步研究了調(diào)控SCAR表達(dá)量的上游機(jī)制。通過(guò)CLIP-seq、RIP及q-PCR實(shí)驗(yàn)表明，肝成纖維細(xì)胞在脂質(zhì)暴露的情況下發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）導(dǎo)致CHOP蛋白表達(dá)量下降，進(jìn)一步使PGC-1α表達(dá)量下降（圖4A），PGC-1α通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄（圖4B），從而最終使得SCAR的表達(dá)降低（圖4C）。

結(jié)果展示

圖1. Arraystar Human CircRNA芯片篩選及驗(yàn)證結(jié)果。

A：差異circRNA聚類圖（FC≥2，P<0.05，n=4），在NASH模型病人中找到一個(gè)明顯下調(diào)的環(huán)狀RNA分子SCAR（hsa_circ_0089762）。
B：SCAR對(duì)應(yīng)在線粒體基因組上的位置（以紅框標(biāo)注）。
C：Rnase R處理后，Q-PCR驗(yàn)證SCAR的環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及SCAR在NASH患者中的表達(dá)情況。
D：NASH患者肝臟硬度與SCAR成纖維細(xì)胞數(shù)目的相關(guān)性分析。

圖2. 過(guò)表達(dá)SCAR抑制NASH相關(guān)表型。

A：正常肝成纖維細(xì)胞在使用棕櫚酸酯模擬脂質(zhì)暴露的情況下，過(guò)表達(dá)SCAR對(duì)于細(xì)胞質(zhì)中ROS（cROS）含量的影響。
B：Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)SCAR對(duì)于NASH患者肝成纖維細(xì)胞活化的影響。
C：過(guò)表達(dá)SCAR對(duì)NASH患者肝成纖維細(xì)胞收縮性的影響。
D：過(guò)表達(dá)SCAR后NASH患者肝成纖維細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子總量變化情況。
E：在高脂喂養(yǎng)小鼠模型中，過(guò)表達(dá)SCAR導(dǎo)致肝組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞減少。

圖3. SCAR發(fā)揮功能的下游機(jī)制。

A：RNA pull down以及質(zhì)譜檢測(cè)SCAR結(jié)合蛋白。
B：RIP實(shí)驗(yàn)鑒定ATP5B與SCAR的結(jié)合情況。
C：SCAR影響CypD與ATP5B的結(jié)合。
D：SCAR與CypD對(duì)于肝成纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中ROS釋放的影響。
E：ELISA檢測(cè)SCAR與CypD對(duì)于肝成纖維細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響。

圖4. 調(diào)控SCAR表達(dá)量的上游機(jī)制。

A：棕櫚酸酯模擬脂質(zhì)暴露的情況下，CHOP表達(dá)量上升，PGC-1α表達(dá)量下降，敲低CHOP蛋白后PGC-1α表達(dá)量降低。
B：ChIP實(shí)驗(yàn)分析棕櫚酸酯處理下PGC-1α與SCAR啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合情況。
C：PGC-1α敲低抑制SCAR表達(dá)。

研究意義

作者利用Arraystar Human CircRNA芯片在NASH患者肝成纖維細(xì)胞中找到了影響NASH發(fā)生發(fā)展的線粒體定位環(huán)狀RNA分子SCAR，在臨床樣本驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)SCAR的表達(dá)與人體肝臟健康程度顯著相關(guān)。細(xì)胞層面上的功能研究表明SCAR與線粒體ROS釋放相關(guān)，并且能夠抑制肝成纖維細(xì)胞的活化以及炎癥因子的釋放，而小鼠模型上的研究則表明SCAR能夠減輕肝硬化的表型。最后作者通過(guò)一系列的機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)暴露的情況下出現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致CHOP及其下游PGC-1α的減少，進(jìn)而導(dǎo)致SCAR的表達(dá)量下降。SCAR的減少會(huì)導(dǎo)致原本與其結(jié)合的ATP5B轉(zhuǎn)而與CypD結(jié)合，從而使線粒體上mPTP通道開(kāi)放并將ROS釋放到細(xì)胞質(zhì)中最終引起NASH�？傮w而言，這項(xiàng)工作思路清晰，數(shù)據(jù)詳實(shí)，具有很高的科研價(jià)值與應(yīng)用價(jià)值，為NASH的治療提供了新的思路與方法。

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