公益基金會(huì)癌癥研究小組 植田 幸嗣

　　外泌體是一種微分泌囊泡。它是細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的產(chǎn)物之一，具有將不需要的分子釋放出細(xì)胞外并將內(nèi)含分子運(yùn)輸和傳遞到遠(yuǎn)端細(xì)胞的功能。通常，外泌體具有直徑為幾十至一百納米的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分相比，特定蛋白質(zhì)組（四次跨膜蛋白超家族，Rab家族，Tsg101，Alix等）和miRNA的含量特別多。然而，有研究結(jié)果指出，通過細(xì)分粒徑進(jìn)行組學(xué)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)特定粒徑的分子結(jié)構(gòu)明顯不同¹），所以目前外泌體的分子生物學(xué)定義仍未明確。事實(shí)上，有不少研究通過使用各種不同的外泌體提取方法（使用提取純度不同的外泌體樣本）進(jìn)行的功能分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外泌體參與癌癥轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤、血管新生、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)等現(xiàn)象。

　　事實(shí)表明，"致病細(xì)胞的分子譜可以從其釋放到體液（如外周血等）的外泌體中讀取。”以診斷為目的外泌體應(yīng)用正逐漸商業(yè)化。例如，CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室推出的檢測產(chǎn)品，可從尿液外泌體中同時(shí)檢測出前列腺癌三種特異性RNA：PCA3 non-coding RNA、ERG mRNA、SPDEF mRNA。并且可以作為LDT（Laboratory Developed Tests：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部研發(fā)、驗(yàn)證、使用的體外診斷測試）進(jìn)行國際委托技術(shù)服務(wù)²）。此外，該實(shí)驗(yàn)室還建立了一項(xiàng)從血漿中一步分離外泌體DNA/RNA及cfDNA（circulating free DNA）的技術(shù)，并發(fā)表了一項(xiàng)關(guān)于檢測非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者血漿中表皮生長因子受體EGFR-T790M突變的研究。該突變導(dǎo)致60％接受EGFR抑制劑治療的肺癌患者產(chǎn)生耐藥性。若出現(xiàn)EGFR突變，就需及時(shí)替換Osimertinib等有效藥物進(jìn)行治療。因此，快速的耐藥診斷非常重要。通過對210例EGFR突變肺癌患者的對比試驗(yàn)，目前認(rèn)可的cfDNA診斷法檢測T790M的靈敏度是58%，特異性是80%；而EGFR T790M 檢測的靈敏度是92%，特異性是89%。相比之下，EGFR T790M 檢測可獲得更好的診斷結(jié)果³）。

　　在此背景下，無論是基礎(chǔ)生物學(xué)研究還是臨床應(yīng)用，都需要實(shí)驗(yàn)室之間能夠零差異再現(xiàn)的高純度外泌體，一種任何人都能輕松分離和純化外泌體的工具是不可或缺的。特別是，如果研究對象是從血清和血漿樣本中提取純化的外泌體蛋白，則需要非常高的純化水平。血清•血漿的蛋白濃度超過60mg/mL，還存在許多高分子量復(fù)合物如脂蛋白，即使是外泌體提取常用的超速離心沉淀法，仍然會(huì)存在大量血清游離蛋白（IgM，α2 -巨球蛋白，補(bǔ)體成分等）和脂蛋白。因此，通過LC/MS對超速離心法提取的血清蛋白進(jìn)行全面定量蛋白質(zhì)組分析時(shí)，幾乎所有含量都是血清游離蛋白，只檢測出了微量的外泌體蛋白⁴。

　　除超速離心法外，外泌體的提取方法還有抗體親和法、聚合物沉淀法、凝膠過濾法以及從切除的組織浸液中直接回收的方法⁵） 等。MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS（下文稱為MagCapture試劑盒）的原理是親和純化磷酯酰絲氨酸PS （磷酯酰絲氨酸是構(gòu)成外泌體膜的脂質(zhì)之一）。與其它方法相比具有各種各樣的優(yōu)點(diǎn)。固定在磁珠上的Tim-4蛋白與PS在鈣離子存在的條件下結(jié)合，通過螯合劑洗脫，可以不洗脫非特異性磁珠結(jié)合蛋白而特異性洗脫外泌體，因此提取的純度很高。另外，只要磁珠純化操作可以順利進(jìn)行，就不受樣本容量的限制，即使是用稀釋的樣本也同樣有效。此外，由于在沒有變性溶解的情況下進(jìn)行洗脫，后續(xù)的粒子計(jì)數(shù)檢測、顯微鏡檢查和細(xì)胞給藥實(shí)驗(yàn)等應(yīng)用均可放心使用。

　　根據(jù)圖1A的方法，從相同血清中提取外泌體，并通過Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀進(jìn)行綜合蛋白質(zhì)組分析。結(jié)果顯示，超速離心提取外泌體的總蛋白質(zhì)鑒定數(shù)為612種，MagCapture試劑盒提取外泌體的總蛋白質(zhì)鑒定數(shù)為1,103種，后者是前者的約1.8倍（圖1B）。這是因?yàn)槌�速離心法的血清中殘留大量的游離蛋白質(zhì)，掩蓋了微量外泌體來源的信號(hào)。此外，比較鑒定的蛋白質(zhì)以及相對定量值，可以看出，MagCapture試劑盒提取的外泌體中，被認(rèn)為是外泌體標(biāo)記蛋白的恒定分子組合以及相對含量都要更多（圖2）。由此可見，通過試劑盒提取的外泌體純度遠(yuǎn)高于現(xiàn)有的超速離心沉淀法。

圖1. 提取純度對外泌體蛋白質(zhì)組分析的影響
A）通過超速離心沉淀法和MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS提取血清中的外泌體并進(jìn)行質(zhì)譜分析
B）鑒定出的蛋白數(shù)量和重疊部分

　　使用高純度的外泌體，有利于闡明外泌體的功能以及探索診斷和治療藥物，使研究結(jié)果更具可信度。從外泌體提取的純度、靈活性、可重復(fù)性等方面來看，MagCapture試劑盒適合作為所有外泌體研究的起點(diǎn)。但是，通過該試劑盒回收的產(chǎn)物也是一組含有大量PS膜組分的無限定尺寸的集合，是否等同于其他現(xiàn)有研究指出的外泌體，還需要后期的組學(xué)分析來進(jìn)行仔細(xì)評(píng)估和定義。隨著包括MagCapture試劑盒在內(nèi)的提取純化技術(shù)以及檢測技術(shù)的發(fā)展，我們期待對外泌體的本質(zhì)闡明和臨床應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展。

 
 
圖2. 鑒定外泌體蛋白質(zhì)的定量頂視圖
A)   MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS及B)超速離心沉淀法提取血清中外泌體的蛋白質(zhì)組定量分析結(jié)果
B）收集并記錄了有報(bào)道作為外泌體標(biāo)記物的蛋白。

◆參考文獻(xiàn)
[1] Zhang, H. et al. :"Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation", Nat. Cell Biol., 20, 332（2018）.
[2] McKiernan, J. et al . :"A Novel Urine Exosome Gene Expression Assay to Predict High-grade Prostate Cancer at Initial Biopsy", JAMA. Oncol., 2, 882（2016）.
[3] Castellanos-Rizaldos, E. et al . :"Exosomebased Detection of EGFR T790M in Plasma from Non-Small Cell Lung Cancer Patients", Clin. Cancer Res ., DOI : 10.1158/1078-0432. CCR-17-3369（2018）.
[4] 植田幸嗣：「プロテオーム解析から見たバイ オマーカーとしてのエクソソームとその特 徴」, 細(xì)胞工學(xué), 32, 71（2013）.
[5] Jingushi, K. et al. :"Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin", Int. J. Cancer , 142, 607（2018）.

注：該文章來自和光純藥時(shí)報(bào)Vol.86 No.3 10-11頁 『第２回 エクソソームのプロテオーム解析』（譯：寶柏·中國）

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