論文標題：ALKBH10B Is an RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition
刊登日期：2017年12月
發表雜志：Plant Cell
影響因子：8.68
研究機構：北京大學賈桂芳/何川課題組

前言

目前國內外大部分RNA甲基化研究都集中在基礎生物學與醫學方向，而關于植物RNA甲基化的研究仍然偏少。2014年何川/賈桂芳課題組在Nature Communications上發表研究，利用m6A-seq首次對擬南芥RNA甲基化進行了報道。另外中科院北京基因組研究所以及西北農林科技大學也分別在RNA Biology及Genome Biology上利用m6A-seq對水稻和擬南芥的不同組織部位進行研究。

擬南芥中已鑒定了大量RNA甲基化酶，如METTL3同源基因MTA、METTL14同源基因MTB、WTAP同源基因FIP37以及KIAA1429同源基因Virilizer。去甲基化酶包括ALKBH9A, ALKBH9B, ALKBH9C, ALKBH10A以及ALKBH10B等。其中MTA介導擬南芥胚胎后的轉錄調控，FIP37與MTA互作，是甲基化酶復合物重要組成部分。

在本文中，賈桂芳課題組利用擬南芥ALKBH10b（At4g02940）突變體研究去甲基化酶如何對擬南芥開花早期的成花轉變進行調控。結果顯示，ALKBH10b通過介導FT, SPL3和SPL9的去甲基化修飾，并且證實幼年期→成年期關鍵分子miR-156不參與調控該通路，而是ALKBH10b特異性調控擬南芥成花轉變過程。最后論文通過RNA甲基化測序m6A-seq挖掘了1000多個基因發生了差異甲基化修飾，這些基因直接或間接受到了ALKBH10b的影響。

論文框架與流程

體外實驗證實ALKBH10b行使去甲基化作用

作者先使用BLAST算法，把人源ALKBH5酶與擬南芥的幾種酶進行同源序列比對分析，列出了五個候選酶：ALKBH9A, ALKBH9B, ALKBH9C, ALKBH10A和ALKBH10b。結果顯示，ALKBH10b在擬南芥幾乎所有組織中表達豐度都很高，而且在花期表達量最高。ALKBH9B和ALKBH9C這兩種酶的豐度緊接其后。

作者在下一步使用ALKBH9B和ALKBH9C兩種擬南芥突變體來驗證m6A修飾水平，結果表明mRNA甲基化水平并無明顯變化。所以作者選定ALKBH10b作為后續的研究目標。

接下來作者分別結合使用了煙草瞬間轉染實驗以及純化后的ALKBH10b來研究去甲基化酶在體外的修飾現象。LC-MS/MS分析表明，m6A甲基化水平在體外降低了50%。

最后作者將ALKBH10b行使催化活性關鍵結構域上的氨基酸殘基H366A/E368A進行突變后，ALKBH10b的去甲基化修飾活性被破壞。此外作者還比較了人源ALKBH5在同等條件下與ALKBH10b是否在催化能力上相似。結果表明，ALKBH10b比ALKBH5在催化ssRNA上活性略低，而具有莖環結構的structured RNA兩者并無明顯差別。另外ALKBH10b只對m6A有特異性去甲基化催化功能，而m1A則沒有催化功能。

帶有m6A甲基化修飾的mRNA為ALKBH10b的底物

為了在擬南芥體內驗證ALKBH10b的功能，作者構建了2個突變體：alkbh10b-1（ALKBH10B FeII結合位點前外顯子插入T-DNA）和alkbh10b-2（ALKBH10B預測α-KG結合位點前內含子插入T-DNA）。RT-PCR實驗表明alkbh10b-1幾乎不產生任何ALLBH10b的轉錄本，而alkbh10b-2只產生不到5%的轉錄本。

當去甲基化酶ALKBH10b催化功能被破壞后，RNA整體的m6A/A的比例開始升高（即甲基化水平上升）。接下來作者進行補救實驗（rescue）對alkbh10b-1和alkbh10b-2進行了ALKBH10b的過表達實驗，擬南芥表型得到補救恢復到野生型但alkbh10b-1補救效果比alkbh10b-2要更優。在野生型中過表達ALKBH10b（35S），甲基化水平也是顯著下降。

作者對其他幾種甲基化轉移酶如MTA、MTB、FIP37等進行了qPCR驗證，發現并無明顯差異。表明ALKBH10b直接參與RNA的去甲基化修飾，使得擬南芥m6A水平發生變化且與甲基化轉移酶無關。

已經有大量的研究，尤其是動物中，核糖體RNA、tRNA等也存在可逆化甲基化修飾和去甲基化修飾。但是最后作者在擬南芥中證實，rRNA和tRNA并不受ALKBH10b的調控，且ALKBH10b也不會對其他類型的堿基修飾如m1A、m5C、m1G等有去甲基化的修飾作用。

所以ALKBH10b的底物不具有廣譜性，既不會對rRNA、tRNA上的m6A有去甲基化修飾作用，也不會對其他修飾如m1A等有催化功能。

ALKBH10b影響擬南芥成花轉變和營養生長

作者對alkbh10b-1突變體進行長時間觀察后發現，野生型在展開第12片真葉（true leaves）后開花，而alkbh10b-1則花蕾綻放前額外多出了7片真葉。相反的是，在野生型中過表達ALKBH10b在產生7片真葉后提早進入花期。在alkbh10b-1突變體中進行ALKBH10b補救實驗，可對alkbh10b-1中原本ALLBH10b產生缺陷的表型進行補救，從而恢復到野生型的表型水平。然后，針對alkbh10b-1進行ALKBH10b H366A/E368A（即催化結構域被突變的ALKBH10bm）的補救后，發現表型依舊沒有恢復到野生型水平。最后作者得出結論ALKBH10b功能缺失后成花轉變延后，營養生長受到抑制。

ALKBH10b介導去甲基化修飾提升開花關鍵基因轉錄水平

已知FT基因（Flowering Locus T）參與擬南芥葉片光周期、葉片春化、赤霉素和衰老通路。在alkbh10b-1突變體中，FT基因表達量顯著降低，花期延后。說明ALKBH10b能夠調節FT基因的豐度最終影響成花轉變。為了進一步證實m6A甲基化修飾參與FT表達，作用使用了m6A-RIP-qPCR技術對FT甲基化水平進行檢測后發現，超過50%的FT在alkbh10b-1中發生了m6A甲基化修飾，而野生型中m6A修飾水平不到30%。此外，與FT基因相關的SPL3和SPL9在alkbh10b-1突變體中甲基化水平也是顯著提升，轉錄水平顯著下降。通過m6A-RIP-qPCR技術對片段化的mRNA進行檢測后發現，FT基因Peak主要位于起始及終止密碼子，SPL3及SPL9的Peak主要位于3’ UTR區域。所以結合m6A-RIP-qPCR實驗不僅證明了ALKBH10b直接參與介導FT、SPL3和SPL9的去甲基化修飾，同時表明去甲基化修飾是一種轉錄后調控基因表達水平的一種方式。

ALKBH10b維持FT, SPL3和SPL9的穩定性并影響成花轉變

在哺乳動物中，先前已有大量實驗證實YTHDF2作為reader可以對發生甲基化的mRNA進行降解。為了在擬南芥中證實這種猜想，作者開展了兩項獨立實驗來對FT基因在整個生命周期中的降解情況進行實時監控：a. 在轉錄水平最高的白天Z16期前使用轉錄抑制劑放線菌素D（actinomycin D）監控FT的轉錄水平；b. 在夜晚Z16后檢測FT的降解水平。兩種方法同時證實在alkbh10b-1突變體中FT降解速度比野生型擬南芥更快。這個現象表明，當擬南芥中甲基化水平提升時，mRNA會加速降解。當在alkbh10b-1中進行ALKBH10b過表達時，FT甲基化水平降低，mRNA維持穩定性（即不被快速降解）。

已知miR-156調控SPL基因。賓夕法尼亞大學的Scott教授與浙江農林大學的吳剛教授首次發現miR-156是控制植物幼年向成年階段轉變的主控因子，并揭示了控制該發育進程的信號通道。但是在本次實驗中，作者證實miR-156并不參與調控SPL3和SPL9。這表明SPL3和SPL9轉錄水平下降與miR-156沒有關聯。所有結果均表明去甲基化酶ALKBH10b能夠維持FT、SPL3和SPL9 mRNA的穩定性。

FT、SPL3和SPL9的高甲基化水平能夠加速降解，而FT的缺失導致花期延后。在葉片中，SPL9能夠激活miR-172從而調控花期，而SPL3能夠直接與FT的啟動子相結合。在alkbh10b-1中miR-172成熟體和前體數量均顯著下降。所以SPL3和SPL9因為高甲基化修飾導致轉錄水平下降，使得FT和miR-172受到抑制，從而導致成花轉變延后。
 
ALKBH10b缺失導致擬南芥整體m6A修飾水平降低

作者使用了m6A-seq和轉錄組測序等手段，通過多組學聯合分析最終發現在野生型擬南芥中的9210多個基因挖掘到了12922多個Peak；alkbh10b-1突變體的8000多個基因上挖掘12975個Peak。差異分析表明，alkbh10b-1中共鑒定到1190個基因存在1276過甲基化修飾Peak。m6A修飾主要位于TSS、TES以及3’ UTR和5’ UTR附近。本次測序結果，m6A Peak基本集中在RRACH motif內。GO功能富集分析表明，差異基因基本與器官組織發育、生殖成熟及開花轉換等功能相關。這個結果與之前alkbh10b-1表型一致。

總結

這篇文章詳細闡述了去甲基化酶介導的m6A修飾可以維持與花期相關基因的mRNA穩定性，從而影響下游通路基因功能，為植物發育的研究提供了新思路。