標題：m6A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition
日期：2017年2月
雜志：Nature
IF：40.1
機構：美國芝加哥大學何川課題組

1.摘要

在胚胎發育早期，由母本→合子過渡（maternal-to-zygotic, MZT）是一個十分重要的過程。然而在大部分脊椎動物體內，MZT的時序是如何被塑造的其機制目前仍然未知。在哺乳動物發育早期，胚胎中來自母源mRNA會產生大量的蛋白。一旦度過MZT后，胚胎的基因組會被激活，而YTHDF2會將母源mRNA進行清除。來自芝加哥大學的何川教授課題組發現，胚胎中超過三分之一的母源mRNA上存在m6A修飾，這些mRNA之后會被YTHDF2清除。YTHDF2一旦被敲除后，帶有m6A修飾的母源mRNA半衰期顯著上升，合子基因組激活受阻。這些胚胎無法及時啟動MZT，細胞周期發生中止從而導致斑馬魚子代發育延緩。

2．正文

在斑馬魚胚胎發育的早期，YTHDF2幾乎處于一個高表達的狀態，作者使用TALEN技術對YTHDF2進行了敲除。轉錄組測序結果表明YTHDF2純合突變，在胚胎期表達量始終低于野生型。

作者將雜合突變+/-的雄魚和雌魚進行交配后，發現純合突變的F1代發育正常。

作者對純合突變的F1代進行交配，發現超過97%的F2代mid-blastula transition（MBT）延緩，超過70%的F2代均發育異常，不能跨過胚胎發育的第一個階段。這種強致死作用可能是雄魚有缺陷的精子造成的。為了鑒定母源YTHDF2的功能，作者將純合突變雌魚與野生型雄魚進行交配。

作者對純合突變的胚胎和野生型胚胎整個發育周期進行觀察后發現，YTHDF2野生型胚胎在受精后3.7小時（hpf）后僅僅20分鐘就開始呈橢圓形，而YTHDF2純合突變則需要足足45分鐘且細胞分裂持續進行。在7hpf需要開始形成原腸胚售時，突變胚胎用于發育pseudo-sphere和pseudo-50% epiboly少了約半小時（相對于野生型的5h.p.f）。原腸胚發育在純合突變胚胎中至少被推遲了發育階段的第一個30小時。YTHDF2補救實驗表明，當向胚胎中注射YTHDF2，上述癥狀會恢復。所有結果都證實胚胎發育一些表型缺失現象由YTHDF2引起。

作者對YTHDF2突變型胚胎和野生型胚胎中MBT前后DNA總量進行檢測發現，突變型中DNA總量顯著低于野生型，這表明這段時間內細胞分裂事件較少。在細胞分裂中期和后期，突變型中缺少可識別的PH3蛋白。人為注射YTHDF2進行補救后，以上癥狀恢復，表明YTHDF2突變后細胞會在G2晚期或M早期停滯。所有結果均證實YTHDF2在MZT期間，對細胞的正常發育至關重要。

作者對胚胎發育的5個hpf階段進行了轉錄組測序，將表達的轉錄本分為三個大類即母源maternal、半穩定semistable和合子zygotic，又根據時間前后分為early和late。緊接著又使用m6A-seq和miCLIP-seq，胚胎發育期5個hpf階段mRNA上堿基m6A修飾水平進行了高分辨率鑒定并取交集。超過40%的轉錄本上有m6A peak，超過36%的母源mRNA被m6A修飾。母源mRNA在4hpf后顯著降低，同時mRNA整體m6A修飾水平也是逐漸降低。在MZT期間，發生m6A修飾的轉錄本整體數量上維持一個很高的水平，而m6A修飾水平在此期間會有波動。RRACH motif在起始密碼子和終止密碼子附近顯著富集。下一步，作者將母源轉錄本分為甲基化和非甲基化兩類。與非甲基化轉錄本相比，發生甲基化轉錄本在4hpf前一直維持較高水平，之后表達水平逐漸降低。功能富集分析顯示這些轉錄本主要集中在磷代謝相關如ATP-binding以及cell cycle regulation functions等。而那些非甲基化轉錄本的功能主要富集在氮代謝。

作者對YTHDF2純合突變和野生胚胎在5個時間點進行了轉錄組測序。差異分析結果表明MBT 4hpf時轉錄本差異最大。由于YTHDF2缺失導致母源mRNA顯著上調，而野生型胚胎中4hpf時mRNA含量顯著下降。下一步作者采用了mRNA翻譯抑制劑MO模擬YTHDF2基因功能缺失。轉錄組數據表明，其結果與YTHDF2基因功能缺失產生的現象很相似。這些結果都證實YTHDF2有助于在胚胎中清除母源mRNA，該基因如果發生功能缺失會導致胚胎基因組激活受阻。

由于在4hpf時，純合突變的胚胎中mRNA的m6A修飾水平達顯著上升了50%。所以作者推測YTHDF2可能在4hpf時開始作用于那些發生甲基化的mRNA。接下來作者分別對YTHDF2純合突變胚胎和MO處理的胚胎進行了m6A-seq和miCLIP-seq，將顯著差異上調的基因中的20%列為候選的YTHDF2靶基因，韋恩圖取交集后135個基因標為Most stringent targets。這135個靶基因主要功能富集在磷代謝、細胞周期和生殖等功能上。其中mtus1a、mylipa、setdb1a、vps26a和zgc:162879參與調解細胞周期，而buc和tdrd1主要涉及生殖細胞產生等功能。qPCR實驗表明突變胚胎中mRNA相對表達量遠遠大于野生型胚胎。所以由于YTHDF2缺失導致母源甲基化mRNA在胚胎中保留時間過長從而引起斑馬魚早期發育延緩。

為了驗證帶有m6A修飾的mRNA能夠激活YTHDF2的清除功能，作者將GFP熒光蛋白mRNA（分別帶有和不帶有m6A修飾）注射進入胚胎細胞中并用qPCR驗證。結果表明，在野生型胚胎中帶有m6A修飾的mRNA被降解的速度更快，在YTHDF2突變型胚胎中，發生m6A修飾的mRNA降解受到影響。相似的實驗結果也在MO處理組得到重現。在熒光顯微鏡下，YTHDF2突變型胚胎中熒光強度顯著高于野生型。所有這些結果都表明m6A甲基化會影響靶基因的穩定性，而斑馬魚胚胎中YTHDF2能夠直接介導母源mRNA的降解/清除。

在本文最開始的實驗中，作者將YTHDF2純合突變的雄魚和雌魚進行交配。產生的子代中存活率約為30%，且這些子代均不含有母源YTHDF2和合子自身表達的YTHDF2。作者進一步證實合子中表達的YTHDF2也能參與母源mRNA降解。但是在胚胎發育早期，YTHDF2似乎只能激活母源mRNA降解而不是合子中的mRNA。

先前已有報道稱miR-430介導脫腺苷酸化從而對mRNA進行降解并與YTHDF2高度重疊。YTHDF2先作用于靶基因，緊接著是miR-430。RNA降解時序反應再次表明母源YTHDF2在合子中介導mRNA降解反應，之后miR-430繼續“接力”下游的mRNA降解反應。盡管不同分子降解機制有所不同但是miR-430、YTHDF2以及靶基因從時序上來看高度重疊，各種實驗結果結合到一起都不遺余力地強有力地證實了機制不同時序相同的不同清楚機制對母源mRNA降解極其重要。