論文標題：N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing
刊登日期：2015年03月
發表雜志：Nature
影響因子：40.1
研究機構：美國洛克菲勒大學
技術手段：m6A-seq，小RNA芯片，細胞敲低和過表達，qRT-PCR等

1.摘要

在miRNA生物合成的第一步是在微處理蛋白復合物的幫助下對初級microRNA（pri-miRNA）進行加工。微處理蛋白復合物由RNA結合蛋白DGCR8和III型核糖核酸酶Drosha組成。這個起始事件需要DGCR8識別pri-miRNA發夾上莖和側翼單鏈RNA的連接處，并招募Drosha剪切雙鏈RNA產生前體miRNA（pre-miRNA）。pri-miRNA的加工機制已經被闡釋，但是目前并不知道DGCR8在眾多具有二級結構的轉錄本中識別和結合pri-miRNA的機制。

本研究中，洛克菲勒大學Dr.Tavazoie教授的課題組發現在哺乳動物細胞中，METTL3會使pri-miRNA發生甲基化，標記的pri-miRNA可以被DGCR8的識別和加工。通過miRNA芯片分析發現，敲低METTL3會降低DGCR8與pri-miRNA的結合作用，引起成熟體miRNA表達量降低，通過未經加工pri-miRNA含量增加。體外實驗證實m6A會促進pri-miRNA的加工。最后，功能驗證實驗揭示METTL3能夠促使miRNA成熟。

本研究結果表明，m6A標記是一個關鍵的轉錄后修飾，會促進miRNA生物合成的起始。

2.METTL3直接介導pri-miRNA加工

這篇文章的作者在先前的研究中已經證實，轉錄后的堿基修飾能夠調控miRNA的加工過程。作者通過FIRE算法在pri-miRNA中找到了高豐度GGAC motif。這種motif與許多已發表的文獻中METTL3識別的RGAC motif很相似。與很多pri-miRNA相反的是，這種motif并沒有在miRNA前體序列（pre-miRNA）中富集。

接下來為了證實這種現象是否與METTL3酶相關，作者對乳腺癌細胞系MDA-MB-231使用了m6A-seq（也叫MeRIP-seq）測序，在m6A靶向的pri-miRNA上發現了許多GGAC motif。根據m6A-seq結果搜尋順式調控元件發現METTL3 motif顯著富集。

此外作者使用IGV軟件發現，pri-miRNA上被reads覆蓋程度較高的區域基本都是METTL3的motif并用綠色的小點標記了出來。

為了證實METTL3是否真的參與miRNA加工過程，作者在細胞系中使用兩種短發卡RNA（short hairpin RNA）對METTL3進行干擾并用control shRNA進行對照，然后使用小RNA微流體芯片統計細胞中miRNA整體的表達情況。接下來作者發現miRNA成熟體整體表達量顯著下調。此外，METTL3敲低后對miRNA在基因組不同位置上的影響呈現一定的多樣性，內含子比例最高，接下來是基因間區。

作者對幾個關注的miRNA進行qPCR驗證，發現受METTL3敲低影響，miRNA表達量顯著下調。

另外，METTL3敲低在多種哺乳動物的細胞系中都存在相似的情況，即miRNA表達量都顯著下調。所有結果表明，METTL3無論在腫瘤細胞系還是常規細胞系中都對miRNA表達產生很大的影響。

為了驗證METTL3是否真正影響miRNA加工，作者在細胞系中轉入METTL3過表達載體。結果表明METTL3過表達能夠顯著提高細胞系中miRNA的表達水平。

接下來作者發現METTL3敲低后，pri-miRNA表達量顯著上升。這個結果表明pri-miRNA加工成pre-miRNA和miRNA成熟體需要METTL3來介導參與。

所以無論是METTL3的敲除敲低，還是過表達后改變了其表達量、細胞中亞定位或微處理蛋白復合物的催化活性。實驗結果都表明METTL3直接參與pri-miRNA的加工過程。

3.METTL3直接參與pri-miRNA的m6A甲基化修飾

為了證實METTL3直接參與pri-miRNA的m6A甲基化修飾，作者使用METTL3抗體紫外交聯法（CLIP-seq）進行驗證。結果表明，與m6A-seq測序相似，METTL3 motif被顯著富集。

與m6A-seq測序結果相似，METTL3敲低/敲除后miRNA與METTL3 footprint存在極高的重疊率。

接下來作者采用Phastcons軟件對100多種脊椎動物的miRNA以及METTL3 motif進行分析，結果表明METTL3在不同動物中都是極端保守的。

4.METTL3介導m6A修飾參與pri-miRNA加工

為了證明m6A修飾直接參與pri-miRNA的加工過程，作者獲得了轉染了DGCR8和DROSHA的HEK293細胞提取物。這些提取物被用于驗證pri-miRNA是否含有m6A堿基修飾。通過Northern blot實驗發現，發生甲基化的pri-let-7比未發生甲基化修飾的pri-let-7通過微處理蛋白復合物作用后產生pre-let-7的效率會更高。這個實驗說明m6A甲基化修飾對于pri-miRNA加工成pre-miRNA這一過程至關重要。

接下來，作者對pri-miRNA上容易發生m6A修飾的腺嘌呤苷酸（位于METTL3 motif中的A）進行點突變。已知pri-let-7e上一共含有五個腺苷酸（A），作者分別將五個A全部進行點突變。實驗結果表明，這些被突變的METTL3 motif（也叫作腺嘌呤苷酸A）能夠顯著降低pri-miRNA加工成熟體miRNA的效率。

5.METTL3和DGCR8形成復合物參與pri-miRNA加工 

免疫共沉淀實驗表明METTL3和DGCR8屬于蛋白復合物中的一部分。但是兩者相互作用需要RNA介導，在RNase消化酶的作用下，兩者不能相互結合。接下來作者想要驗證DGCR8是否與發生m6A甲基化的RNA相結合，使用紫外交聯法分離出DGCR8。對DGCR8免疫共沉淀后，m6A免疫印跡法實驗證實DGCR8確實能夠與發生m6A甲基化的RNA相互結合。對METTL3敲除/敲低后能夠顯著降低RNA甲基化水平從而降低DGCR8和RNA結合水平。但是，DGCR8與發生甲基化的RNA并不是直接相結合的，作者通過實驗驗證DGCR8與甲基化RNA和非甲基化RNA相結合并沒有偏好性。

6.DGCR8特異性識別m6A甲基化pri-miRNA

mRNA非常容易形成類似于pri-miRNA一樣的二級結構。為了證實DGCR8是否真正能夠特異性識別pri-miRNA而不是mRNA二級結構這個猜想，作者想要通過降低pri-miRNA的m6A甲基化水平，從而驗證DGCR8蛋白結合的RNA總量是否所有下降。接下來，作者對細胞中的METTL3進行了敲除，并將所有的RNA進行放射性標記。DGCR8免疫共沉淀實驗，METTL3敲除后DGCR8結合的RNA總量和pri-miRNA總量都顯著降低（放射性信號減弱）。這些實驗結果證實，發生m6A甲基化的pri-miRNA能夠被DGCR8特異性識別，并影響后續成熟體miRNA的加工。

7.總結

本文通過上述一系列嚴謹的實驗，首次證明了m6A甲基化修飾是參與miRNA加工過程的一種新型調控方式。METTL3能夠對pri-miRNA上GGAC motif的腺苷酸（A）進行m6A修飾。RNA甲基化修飾能夠促進pri-miRNA被DGCR8特異性識別，從而成為miRNA成熟體加工過程中的一個十分重要的marker。所以作者認為m6A是一種十分重要的RNA標記，這種標記能夠介導激活下游的微處理蛋白復合物，從而啟動pri-miRNA向pre-miRNA和成熟體miRNA等一系列加工過程。因此m6A這種特殊的標記在細胞核中具有重要的作用，即允許微處理蛋白復合物識別具有特定二級結構且發生甲基化的pri-miRNA而不是其他一些底物如具有二級結構的mRNA等。此外，作者也推測METTL3的異常表達可能會引起腫瘤中miRNA的異常高表達。