今天的文章將圍繞RNA甲基化m6A后期驗證工具展開，詳細介紹了幾類高頻的驗證實驗，一起來學習吧~

前言

做完測序后需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進行生物學功能驗證，一個完整的功能驗證將歷經(jīng)分子細胞→細胞功能→動物實驗等形成完整的實驗思路。其中分子細胞包括RNA-RNA互作驗證（如miRNA與UTR互作驗證）等。細胞功能包括敲低/敲除/過表達、蛋白細胞定位、蛋白與蛋白互作、蛋白與RNA/DNA互作、細胞表型實驗（遷移侵襲、劃痕、增殖、凋亡、周期）等。最后的動物實驗主要指動物模型實驗，如小鼠、斑馬魚等。除了qPCR外，接下來的內(nèi)容中會選擇其中幾個高頻的驗證實驗做介紹。

RNA-RNA/DNA互作驗證

提起RNA或DNA分子互作驗證，就不得不提一下雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)。熒光素酶已成為科研中運用最廣泛的報告基因之一，其具有檢測靈敏度高、結(jié)果重復性好、信噪比較高和易于檢測等特點。很多實驗室使用的熒光素酶報告基因載體通常采用了螢火蟲熒光素酶/海參熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)，其中螢火蟲熒光素酶作為檢測報告基因，而海參熒光素酶則作為內(nèi)參報告基因。

因為哺乳動物細胞中不含內(nèi)源性熒光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性螢光素酶。單報告基因?qū)嶒炌�往會受到各種實驗條件的影響，而雙報告基因則通過共轉(zhuǎn)染的“對照”作為內(nèi)參為實驗提供一個基準線，從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實驗的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。

Dual-Luciferase 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細胞中同時表達海參熒光酶。兩者沒有種源同源性并且對應不同的反應底物，故而沒有交叉干擾。得益于超強的光信號和超高的信噪比，本系統(tǒng)被廣泛用于啟動子活性驗證、甲基化酶識別位點驗證、miRNA靶基因驗證、circRNA 與miRNA互作等實驗。具體核酸互作的相關protocol詳見：https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-1708-2_4。

由于miRNA主要通過作用于靶基因的3'UTR起作用，可以將目的基因3'UTR 區(qū)域構建至載體中的報告基因luciferase后面，通過比較過表達或者干擾miRNA后，報告基因表達的改變（監(jiān)測熒光素酶活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用；結(jié)合定點突變等方法確定miRNA 與靶基因3'UTR 的作用位點。
轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構、行使調(diào)控基因表達功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。

熒光素酶報告實驗是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，其原理簡述如下: 第一，用靶啟動子的特定片段替換報告基因質(zhì)粒（如pG L3-basic）的啟動子區(qū)。第二，將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)。如果該轉(zhuǎn)錄因子能移激活靶啟動子，則熒光素酶就會表達，且其表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。第三，加入特定的底物，熒光素酶與底物反應，通過產(chǎn)生熒光的強度可以對熒光素酶的活性進行定量，進而判斷該轉(zhuǎn)錄因子能否與靶啟動子片段發(fā)生作用（及其作用強度）。

敲低/敲除/過表達

通常研究一類基因或miRNA、lncRNA等在細胞中行使什么樣的功能，需要在細胞中對該基因進行敲低（knockdown）、敲除（knockout）或過表達（overexpression）。這就需要將這些干擾質(zhì)粒或過表達質(zhì)粒在慢病毒（Lentivirus）、腺相關病毒（adeno-associated virus）、腺病毒（adenovirus）等入侵載體的幫助下，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進細胞體內(nèi)。

病毒是基因操作可視化的杰出載體。通常慢病毒能快速介導基因敲低/敲除/過表達，可做成細胞穩(wěn)定株進行長期實驗。因為外源基因如果不整合進宿主DNA，只能維持幾天的高表達。傳統(tǒng)的穩(wěn)定株構建方法需要通過外源基因的瞬時轉(zhuǎn)染后對靶細胞進行篩選。而慢病毒是一種RNA病毒，攜帶的外源基因在病毒侵染細胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細胞中后才能表達。這種方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端，可在短時間內(nèi)獲得大量穩(wěn)定細胞株。

腺病毒為雙鏈DNA病毒，與慢病毒不同的是其并不會與宿主DNA發(fā)生整合。細胞被侵染后在1-3天內(nèi)表達，并能夠持續(xù)1-2周，擴散能力強，并且免疫原性較強。

上圖中的三個質(zhì)粒載體示例：分別在基因?qū)用嫔蠈崿F(xiàn)過表達、敲低和敲除的功能。

通常質(zhì)粒載體需要一個最基本的基因表達結(jié)構，包括啟動子、終止子基因等。其中CMV、U6都是很常見的啟動子，后面能放入各種需要表達的基因。另外EGFP是用來發(fā)光的，cas9是CRISPR基因敲除系統(tǒng)中很重要的一種酶，配合gRNA就能對目標區(qū)域的基因進行敲除。

今天的內(nèi)容講完啦，大家記得收藏好慢慢學習哦~

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下期預告：RNA 甲基化 m6A 后期驗證工具之細胞蛋白定位/免疫熒光實驗及蛋白與蛋白互作（免疫共沉淀和 GST pull down）