今天的文章將圍繞RNA甲基化m6A后期驗(yàn)證工具展開(kāi)，詳細(xì)介紹了幾類高頻的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，一起來(lái)學(xué)習(xí)吧~

前言

做完測(cè)序后需要對(duì)分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證，一個(gè)完整的功能驗(yàn)證將歷經(jīng)分子細(xì)胞→細(xì)胞功能→動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等形成完整的實(shí)驗(yàn)思路。其中分子細(xì)胞包括RNA-RNA互作驗(yàn)證（如miRNA與UTR互作驗(yàn)證）等。細(xì)胞功能包括敲低/敲除/過(guò)表達(dá)、蛋白細(xì)胞定位、蛋白與蛋白互作、蛋白與RNA/DNA互作、細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)（遷移侵襲、劃痕、增殖、凋亡、周期）等。最后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要指動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，如小鼠、斑馬魚等。除了qPCR外，接下來(lái)的內(nèi)容中會(huì)選擇其中幾個(gè)高頻的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)做介紹。

RNA-RNA/DNA互作驗(yàn)證

提起RNA或DNA分子互作驗(yàn)證，就不得不提一下雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)。熒光素酶已成為科研中運(yùn)用最廣泛的報(bào)告基因之一，其具有檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果重復(fù)性好、信噪比較高和易于檢測(cè)等特點(diǎn)。很多實(shí)驗(yàn)室使用的熒光素酶報(bào)告基因載體通常采用了螢火蟲(chóng)熒光素酶/海參熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)，其中螢火蟲(chóng)熒光素酶作為檢測(cè)報(bào)告基因，而海參熒光素酶則作為內(nèi)參報(bào)告基因。

因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞中不含內(nèi)源性熒光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性螢光素酶。單報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報(bào)告基因則通過(guò)共轉(zhuǎn)染的“對(duì)照”作為內(nèi)參為實(shí)驗(yàn)提供一個(gè)基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。

Dual-Luciferase 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)海參熒光酶。兩者沒(méi)有種源同源性并且對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，故而沒(méi)有交叉干擾。得益于超強(qiáng)的光信號(hào)和超高的信噪比，本系統(tǒng)被廣泛用于啟動(dòng)子活性驗(yàn)證、甲基化酶識(shí)別位點(diǎn)驗(yàn)證、miRNA靶基因驗(yàn)證、circRNA 與miRNA互作等實(shí)驗(yàn)。具體核酸互作的相關(guān)protocol詳見(jiàn)：https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-1708-2_4。

由于miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3'UTR起作用，可以將目的基因3'UTR 區(qū)域構(gòu)建至載體中的報(bào)告基因luciferase后面，通過(guò)比較過(guò)表達(dá)或者干擾miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測(cè)熒光素酶活性變化）可以定量反映miRNA對(duì)目的基因的抑制作用；結(jié)合定點(diǎn)突變等方法確定miRNA 與靶基因3'UTR 的作用位點(diǎn)。
轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。

熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)這類轉(zhuǎn)錄因子和靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段，其原理簡(jiǎn)述如下: 第一，用靶啟動(dòng)子的特定片段替換報(bào)告基因質(zhì)粒（如pG L3-basic）的啟動(dòng)子區(qū)。第二，將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)。如果該轉(zhuǎn)錄因子能移激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶就會(huì)表達(dá)，且其表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。第三，加入特定的底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，通過(guò)產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度可以對(duì)熒光素酶的活性進(jìn)行定量，進(jìn)而判斷該轉(zhuǎn)錄因子能否與靶啟動(dòng)子片段發(fā)生作用（及其作用強(qiáng)度）。

敲低/敲除/過(guò)表達(dá)

通常研究一類基因或miRNA、lncRNA等在細(xì)胞中行使什么樣的功能，需要在細(xì)胞中對(duì)該基因進(jìn)行敲低（knockdown）、敲除（knockout）或過(guò)表達(dá)（overexpression）。這就需要將這些干擾質(zhì)粒或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在慢病毒（Lentivirus）、腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus）、腺病毒（adenovirus）等入侵載體的幫助下，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞體內(nèi)。

病毒是基因操作可視化的杰出載體。通常慢病毒能快速介導(dǎo)基因敲低/敲除/過(guò)表達(dá)，可做成細(xì)胞穩(wěn)定株進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)。因?yàn)橥庠椿�因如果不整合進(jìn)宿主DNA，只能維持幾天的高表達(dá)。傳統(tǒng)的穩(wěn)定株構(gòu)建方法需要通過(guò)外源基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選。而慢病毒是一種RNA病毒，攜帶的外源基因在病毒侵染細(xì)胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞中后才能表達(dá)。這種方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量穩(wěn)定細(xì)胞株。

腺病毒為雙鏈DNA病毒，與慢病毒不同的是其并不會(huì)與宿主DNA發(fā)生整合。細(xì)胞被侵染后在1-3天內(nèi)表達(dá)，并能夠持續(xù)1-2周，擴(kuò)散能力強(qiáng)，并且免疫原性較強(qiáng)。

上圖中的三個(gè)質(zhì)粒載體示例：分別在基因?qū)用嫔蠈?shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)、敲低和敲除的功能。

通常質(zhì)粒載體需要一個(gè)最基本的基因表達(dá)結(jié)構(gòu)，包括啟動(dòng)子、終止子基因等。其中CMV、U6都是很常見(jiàn)的啟動(dòng)子，后面能放入各種需要表達(dá)的基因。另外EGFP是用來(lái)發(fā)光的，cas9是CRISPR基因敲除系統(tǒng)中很重要的一種酶，配合gRNA就能對(duì)目標(biāo)區(qū)域的基因進(jìn)行敲除。

今天的內(nèi)容講完啦，大家記得收藏好慢慢學(xué)習(xí)哦~

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下期預(yù)告：RNA 甲基化 m6A 后期驗(yàn)證工具之細(xì)胞蛋白定位/免疫熒光實(shí)驗(yàn)及蛋白與蛋白互作（免疫共沉淀和 GST pull down）