今天的文章將圍繞RNA甲基化m6A實驗開展中幾個重要的階段進行介紹，一起來學習吧~

有很多老師和同學上次在后臺留言說上面這張流程圖，也就是m6A實驗整體思路的流程圖還是太復雜太抽象，不好理解。今天我們會來帶領大家如何一步步開展自己的實驗，身臨其境地去體驗m6A實驗的每個階段所要完成的步驟。

這篇文章會有點“啰嗦”，目的在于幫助剛踏入科研的同學們快速梳理自己的思路。如果老師有新的見解，也歡迎提出自己的想法與意見。

階段一：了解什么是RNA甲基化

例如小陳是基礎醫學院直博二年級的研究生，研究方向為新型腫瘤藥物。有一天小陳被導師喊去談談話交交心，導師語重心長地和小陳說RNA甲基化最近很火，讓他看一下這個方向是否可以做一些嘗試。

對于小陳而言，首先他要了解什么是RNA甲基化。簡單地資料搜索后，他從Pubmed上下載了芝加哥大學何川教授和康奈爾大學Jaffrey教授撰寫的相應綜述，并對綜述進行了詳細閱讀。因為這幾位教授都是研究RNA甲基化的大牛，通過他們撰寫的高質量綜述可以避免很多彎路。

仔細研讀綜述后，小陳了解到RNA甲基化中的m6A首先在甲基化轉移酶的作用下對RNA上的腺嘌呤（A）進行m6A修飾，再在去甲基化酶的作用下對已發生m6A修飾的RNA進行去甲基化修飾。最后發生m6A修飾的RNA通過被甲基化閱讀蛋白識別后，行使下游的一系列功能，包括miRNA加工、mRNA出核翻譯及剪切等。

下一步，小陳對幾種參與RNA甲基化的酶進行了系統整理，將其分為Writers、Erasers和Readers。并將這些功能做了一個大致的羅列。

備注：整體時間花費在3-7天，推薦需要閱讀和入門的參考文獻：

Meyer, K., & Jaffrey, S. R. (2017). Rethinking m6A Readers, Writers, and Erasers. Annual Review of Cell & Developmental Biology, 33(1), 319.
Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C. (2014). Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics, 15(5), 293-306.
Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C. (2017). Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell, 169(7), 1187.

階段二：研究他人的課題思路，確定自己的課題方向

在對RNA甲基化進行初步掃盲后，就要進入下一步的研究了。這時候，需要開始大量的閱讀m6A相關論文了，尤其是一些Research articles。這時候也要對經常在高分雜志屠榜的幾個研究m6A的課題組爛熟于心。熟讀他們的論文之后，還需要琢磨發高分的原因究竟在哪里？

通常來說，如果循著高手的足跡，對其實驗思路進行me too似的修改，如換實驗對象、換材料甚至是更換藥物，充其量只能算是一篇copy論文，通常影響因子會下降不少，但是費用開銷反而會增加不少。例如一篇PNAS或者NAR上發表的論文，如果按照其思路進行me too似的copy，文章檔次會被卡死在6分左右。而6分左右的套路沿襲到自己身上，那么4分都很危險。

看到這張圖請不要過于興奮，尤其是miRNA抑制酶的轉錄水平，這種思路基本屬于創新性較差的方向。而甲基化相應的酶調控miRNA就屬于比較新的方向。其他的所有“套路”基本包含在這個流程圖內。一切準備就緒后，就可以正式開啟自己的RNA甲基化實驗之旅啦！

階段三：開啟測序前的一些“預實驗”

階段三所有實驗為可選項，老師也可以跳過這部分直接進入測序部分，來挖掘哪些基因在甲基化修飾上產生了差異。

① 找到差異writers、erasers和readers或者檢測整體m6A水平
② 首先，還是要找到與RNA甲基化相關的酶是否有差異表達。既可以是藥物處理前VS藥物處理后，也可以是腫瘤組織VS癌旁組織，甚至是發育的時間順序，非模式生物不同的組織器官做比較也是考慮的研究方向。

 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）

如上圖所示，作者對肝癌組織、癌旁組織以及正常組織中幾種常見的酶都進行了qPCR驗證，發現FTO和METTL14有差異表達。

另外通過GWAS以及各種人群大隊列分析得到的易感基因正好和RNA甲基化有關，那么這項課題開展下去的意義會更大。這時候RNA甲基化被賦予了新的生命，是上游課題的延續。即全基因組重測序/全外顯子測序/靶向捕獲測序→SNP和Indel分析→GWAS→易感基因→細胞實驗/動物實驗→下游通路和分子機制→最終表型，整個課題會完整會豐滿。

 （Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）

另一種省錢的方式就是從已發表的芯片數據中，直接挖掘幾種酶是否有差異表達。如上圖所示，何川教授和陳建軍教授合作發表在Cancer Cell上的論文，前期就是從網上隊列數據中篩選出FTO基因才繼續進入下游的細胞實驗和動物實驗。

至于檢測m6A整體水平，可采用LC-MS/MS或酶標儀比色法的方式進行。在醫院酶標儀相對于LC-MS/MS普及程度更高，可采用EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit的試劑盒直接進行檢測，方便快捷。

 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）

如上圖所示，作者對肝癌組織、癌旁組織和正常組織在酶標儀上進行了m6A整體的水平檢測后發現，肝癌組織m6A整體水平最低，而正常組織中m6A水平最高。

此外，老師在細胞中對幾種酶進行敲低和過表達后，也可以選擇使用酶標儀來檢測整體的m6A水平是否發生變化。

③ 甲基化酶敲低和過表達細胞實驗

這里對幾種已檢測的甲基化酶進行敲低或過表達，當然這一步老師也可以在一開始直接進行。之后觀察細胞表型和動物表型，建立起相關性關系。通常細胞實驗比較容易開展，老師可以開始進行對應敲低/過表達體系的建立。

 （Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）

如上圖所示，在急性髓細胞白血病AML中，FTO存在表達量顯著上升現象。作者在AML細胞系中，對FTO這個基因進行敲低和過表達后發現AML細胞m6A整體水平降低，凋亡減少。敲低FTO趨勢相反。

③ 甲基化酶敲低和過表達動物模型實驗

 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）

動物模型通常為可選項，老師可以根據自己的經費和實驗整體設計來安排。如上圖所示，作者在小鼠腫瘤模型中對METTL14進行敲低后發現肝癌轉移能力增強。

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階段四：m6A-seq挖掘靶基因

 （Lence et al. (2016) Nature, 540(7632):242-247）

通過m6A-seq測序，老師可以知道究竟哪些基因在RNA甲基化修飾上有差異。如上圖所示，作者對果蠅SR2+細胞進行m6A-seq和轉錄組測序后發現，差異基因都富集在神經功能上。

 （Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）

如果最后的差異基因或者存在甲基化修飾差異的基因過多怎么辦？

這時候，老師可以結合自己先前課題的研究，在這些差異基因中尋找是否包含原有已知的通路和基因。如上圖所示，通過m6A-seq作者在AML發現了幾百個差異基因。初步篩選一般包括功能富集分析等方法。當幾百個基因被限定到11個差異基因時，作者從中發現了RARA和ASB2這2個抑制白血病細胞生長的基因與全反式維甲酸相關。先前研究表明全反式維甲酸治療后ASB2和RARA顯著上調。這樣子，在一大堆候選基因中，范圍繼續縮小。

階段五：靶基因細胞實驗

 （Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）

如上圖所示，在確定ASB2和RARA為去甲基化酶FTO的靶基因后，除了常規的qPCR+WB驗證外，作者還進行了補救實驗（rescue）以及m6A-IP-qPCR（也叫MeRIP-qPCR）。作者用細胞實驗對ASB2和RARA進行敲低并發現AML細胞表型與FTO過表達相似，表型被補救。

在經歷了文獻閱讀、課題設計、測序前“預實驗”、m6A測序及后續常規驗證實驗后，一篇合格的論文已經基本成型。這篇文章基本已符合6分雜志發表要求，下面我們再來介紹一下具體的實驗和所需材料、試劑盒等。

那么如何突破6分文章的瓶頸呢？通常高分文章在此基礎上，會有兩個大方向——臨床和基礎研究。

 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）

在臨床方面，通過上述實驗挖掘到的甲基化酶或者是被調控的下游通路某一個基因或miRNA具有一定的臨床意義會更加容易沖擊高分文章。如上圖所示，在HCC中METTL14低表達與轉移侵染能力在表型上建立了相關性，METTL14在HCC中顯著降低也與性別、乙肝病毒抗原以及微血管轉移相關，METTL14與病人生存周期相關。所以作者最后得出結論，METTL14作為潛在的預后marker與HCC的轉移相關。通過進一步分析發現，METTL14調控miR-126，而miR-126本身能夠抑制腫瘤細胞的轉移能力。那么在之前的基礎上，挖掘到了更深層次的信息。

在基礎生物學方面，可以通過Co-IP甚至是SILAC挖掘到與甲基化酶有互作的一些新蛋白并進行下游驗證。或者可以購買幾種酶的抗體進行RIP實驗后，對富集到的RNA進行分析挖掘，找到幾種酶有互作的RNA甚至是互作區域。接下來對特定的motif進行突變等實驗進行驗證。在這些實驗完成后，如果能發現一種全新的機制一般容易沖擊頂級期刊。

 （Zhao B et al. (2017) Nature, 542 (7642): 475）

如上圖所示，何川教授課題組在斑馬魚胚胎發育期間發現，如果母源的mRNA不被及時清除，容易在胚胎發育后期引起合子基因組激活受阻。其中整篇文章最重要、最關鍵的部分就是YTHDF2在識別帶m6A甲基化修飾的母源mRNA后將其清除。這個現象從一種全新的機制來闡釋，屬于高度原創的工作，論文被Nature收錄。

 （Lence et al. (2016) Nature, 540(7632):242-247）

再比如在果蠅中，性別分化機制由Sxl基因來決定。當性染色體和常染色體比例為2:2時，sxl基因被激活，從而導致下游的tra基因和msl基因接連被激活，最后果蠅發育成雌果蠅。當甲基化酶被敲除時，Sxl基因m6A修飾發生變化，從而調控下游基因的mRNA的剪切，最終雌果蠅壽命受到影響，而雄果蠅則不受影響。這個觀點也屬于首次發現，所以最終發表在Nature上。

RNA甲基化如何發表高分論文，任重而道遠，愿各位老師能夠早日在理想的雜志上發表論文。