今天的文章將圍繞RNA甲基化m6A實驗開展中幾個重要的階段進(jìn)行介紹，一起來學(xué)習(xí)吧~

有很多老師和同學(xué)上次在后臺留言說上面這張流程圖，也就是m6A實驗整體思路的流程圖還是太復(fù)雜太抽象，不好理解。今天我們會來帶領(lǐng)大家如何一步步開展自己的實驗，身臨其境地去體驗m6A實驗的每個階段所要完成的步驟。

這篇文章會有點“啰嗦”，目的在于幫助剛踏入科研的同學(xué)們快速梳理自己的思路。如果老師有新的見解，也歡迎提出自己的想法與意見。

階段一：了解什么是RNA甲基化

例如小陳是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院直博二年級的研究生，研究方向為新型腫瘤藥物。有一天小陳被導(dǎo)師喊去談?wù)勗捊唤恍模瑢?dǎo)師語重心長地和小陳說RNA甲基化最近很火，讓他看一下這個方向是否可以做一些嘗試。

對于小陳而言，首先他要了解什么是RNA甲基化。簡單地資料搜索后，他從Pubmed上下載了芝加哥大學(xué)何川教授和康奈爾大學(xué)Jaffrey教授撰寫的相應(yīng)綜述，并對綜述進(jìn)行了詳細(xì)閱讀。因為這幾位教授都是研究RNA甲基化的大牛，通過他們撰寫的高質(zhì)量綜述可以避免很多彎路。

仔細(xì)研讀綜述后，小陳了解到RNA甲基化中的m6A首先在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下對RNA上的腺嘌呤（A）進(jìn)行m6A修飾，再在去甲基化酶的作用下對已發(fā)生m6A修飾的RNA進(jìn)行去甲基化修飾。最后發(fā)生m6A修飾的RNA通過被甲基化閱讀蛋白識別后，行使下游的一系列功能，包括miRNA加工、mRNA出核翻譯及剪切等。

下一步，小陳對幾種參與RNA甲基化的酶進(jìn)行了系統(tǒng)整理，將其分為Writers、Erasers和Readers。并將這些功能做了一個大致的羅列。

備注：整體時間花費(fèi)在3-7天，推薦需要閱讀和入門的參考文獻(xiàn)：

Meyer, K., & Jaffrey, S. R. (2017). Rethinking m6A Readers, Writers, and Erasers. Annual Review of Cell & Developmental Biology, 33(1), 319.
Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C. (2014). Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics, 15(5), 293-306.
Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C. (2017). Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell, 169(7), 1187.

階段二：研究他人的課題思路，確定自己的課題方向

在對RNA甲基化進(jìn)行初步掃盲后，就要進(jìn)入下一步的研究了。這時候，需要開始大量的閱讀m6A相關(guān)論文了，尤其是一些Research articles。這時候也要對經(jīng)常在高分雜志屠榜的幾個研究m6A的課題組爛熟于心。熟讀他們的論文之后，還需要琢磨發(fā)高分的原因究竟在哪里？

通常來說，如果循著高手的足跡，對其實驗思路進(jìn)行me too似的修改，如換實驗對象、換材料甚至是更換藥物，充其量只能算是一篇copy論文，通常影響因子會下降不少，但是費(fèi)用開銷反而會增加不少。例如一篇PNAS或者NAR上發(fā)表的論文，如果按照其思路進(jìn)行me too似的copy，文章檔次會被卡死在6分左右。而6分左右的套路沿襲到自己身上，那么4分都很危險。

看到這張圖請不要過于興奮，尤其是miRNA抑制酶的轉(zhuǎn)錄水平，這種思路基本屬于創(chuàng)新性較差的方向。而甲基化相應(yīng)的酶調(diào)控miRNA就屬于比較新的方向。其他的所有“套路”基本包含在這個流程圖內(nèi)。一切準(zhǔn)備就緒后，就可以正式開啟自己的RNA甲基化實驗之旅啦！

階段三：開啟測序前的一些“預(yù)實驗”

階段三所有實驗為可選項，老師也可以跳過這部分直接進(jìn)入測序部分，來挖掘哪些基因在甲基化修飾上產(chǎn)生了差異。

① 找到差異writers、erasers和readers或者檢測整體m6A水平
② 首先，還是要找到與RNA甲基化相關(guān)的酶是否有差異表達(dá)。既可以是藥物處理前VS藥物處理后，也可以是腫瘤組織VS癌旁組織，甚至是發(fā)育的時間順序，非模式生物不同的組織器官做比較也是考慮的研究方向。

 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）

如上圖所示，作者對肝癌組織、癌旁組織以及正常組織中幾種常見的酶都進(jìn)行了qPCR驗證，發(fā)現(xiàn)FTO和METTL14有差異表達(dá)。

另外通過GWAS以及各種人群大隊列分析得到的易感基因正好和RNA甲基化有關(guān)，那么這項課題開展下去的意義會更大。這時候RNA甲基化被賦予了新的生命，是上游課題的延續(xù)。即全基因組重測序/全外顯子測序/靶向捕獲測序→SNP和Indel分析→GWAS→易感基因→細(xì)胞實驗/動物實驗→下游通路和分子機(jī)制→最終表型，整個課題會完整會豐滿。

 （Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）

另一種省錢的方式就是從已發(fā)表的芯片數(shù)據(jù)中，直接挖掘幾種酶是否有差異表達(dá)。如上圖所示，何川教授和陳建軍教授合作發(fā)表在Cancer Cell上的論文，前期就是從網(wǎng)上隊列數(shù)據(jù)中篩選出FTO基因才繼續(xù)進(jìn)入下游的細(xì)胞實驗和動物實驗。

至于檢測m6A整體水平，可采用LC-MS/MS或酶標(biāo)儀比色法的方式進(jìn)行。在醫(yī)院酶標(biāo)儀相對于LC-MS/MS普及程度更高，可采用EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit的試劑盒直接進(jìn)行檢測，方便快捷。

 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）

如上圖所示，作者對肝癌組織、癌旁組織和正常組織在酶標(biāo)儀上進(jìn)行了m6A整體的水平檢測后發(fā)現(xiàn)，肝癌組織m6A整體水平最低，而正常組織中m6A水平最高。

此外，老師在細(xì)胞中對幾種酶進(jìn)行敲低和過表達(dá)后，也可以選擇使用酶標(biāo)儀來檢測整體的m6A水平是否發(fā)生變化。

③ 甲基化酶敲低和過表達(dá)細(xì)胞實驗

這里對幾種已檢測的甲基化酶進(jìn)行敲低或過表達(dá)，當(dāng)然這一步老師也可以在一開始直接進(jìn)行。之后觀察細(xì)胞表型和動物表型，建立起相關(guān)性關(guān)系。通常細(xì)胞實驗比較容易開展，老師可以開始進(jìn)行對應(yīng)敲低/過表達(dá)體系的建立。

 （Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）

如上圖所示，在急性髓細(xì)胞白血病AML中，F(xiàn)TO存在表達(dá)量顯著上升現(xiàn)象。作者在AML細(xì)胞系中，對FTO這個基因進(jìn)行敲低和過表達(dá)后發(fā)現(xiàn)AML細(xì)胞m6A整體水平降低，凋亡減少。敲低FTO趨勢相反。

③ 甲基化酶敲低和過表達(dá)動物模型實驗

 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）

動物模型通常為可選項，老師可以根據(jù)自己的經(jīng)費(fèi)和實驗整體設(shè)計來安排。如上圖所示，作者在小鼠腫瘤模型中對METTL14進(jìn)行敲低后發(fā)現(xiàn)肝癌轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

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階段四：m6A-seq挖掘靶基因

 （Lence et al. (2016) Nature, 540(7632):242-247）

通過m6A-seq測序，老師可以知道究竟哪些基因在RNA甲基化修飾上有差異。如上圖所示，作者對果蠅SR2+細(xì)胞進(jìn)行m6A-seq和轉(zhuǎn)錄組測序后發(fā)現(xiàn)，差異基因都富集在神經(jīng)功能上。

 （Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）

如果最后的差異基因或者存在甲基化修飾差異的基因過多怎么辦？

這時候，老師可以結(jié)合自己先前課題的研究，在這些差異基因中尋找是否包含原有已知的通路和基因。如上圖所示，通過m6A-seq作者在AML發(fā)現(xiàn)了幾百個差異基因。初步篩選一般包括功能富集分析等方法。當(dāng)幾百個基因被限定到11個差異基因時，作者從中發(fā)現(xiàn)了RARA和ASB2這2個抑制白血病細(xì)胞生長的基因與全反式維甲酸相關(guān)。先前研究表明全反式維甲酸治療后ASB2和RARA顯著上調(diào)。這樣子，在一大堆候選基因中，范圍繼續(xù)縮小。

階段五：靶基因細(xì)胞實驗

 （Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141）

如上圖所示，在確定ASB2和RARA為去甲基化酶FTO的靶基因后，除了常規(guī)的qPCR+WB驗證外，作者還進(jìn)行了補(bǔ)救實驗（rescue）以及m6A-IP-qPCR（也叫MeRIP-qPCR）。作者用細(xì)胞實驗對ASB2和RARA進(jìn)行敲低并發(fā)現(xiàn)AML細(xì)胞表型與FTO過表達(dá)相似，表型被補(bǔ)救。

在經(jīng)歷了文獻(xiàn)閱讀、課題設(shè)計、測序前“預(yù)實驗”、m6A測序及后續(xù)常規(guī)驗證實驗后，一篇合格的論文已經(jīng)基本成型。這篇文章基本已符合6分雜志發(fā)表要求，下面我們再來介紹一下具體的實驗和所需材料、試劑盒等。

那么如何突破6分文章的瓶頸呢？通常高分文章在此基礎(chǔ)上，會有兩個大方向——臨床和基礎(chǔ)研究。

 （Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529）

在臨床方面，通過上述實驗挖掘到的甲基化酶或者是被調(diào)控的下游通路某一個基因或miRNA具有一定的臨床意義會更加容易沖擊高分文章。如上圖所示，在HCC中METTL14低表達(dá)與轉(zhuǎn)移侵染能力在表型上建立了相關(guān)性，METTL14在HCC中顯著降低也與性別、乙肝病毒抗原以及微血管轉(zhuǎn)移相關(guān)，METTL14與病人生存周期相關(guān)。所以作者最后得出結(jié)論，METTL14作為潛在的預(yù)后marker與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，METTL14調(diào)控miR-126，而miR-126本身能夠抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。那么在之前的基礎(chǔ)上，挖掘到了更深層次的信息。

在基礎(chǔ)生物學(xué)方面，可以通過Co-IP甚至是SILAC挖掘到與甲基化酶有互作的一些新蛋白并進(jìn)行下游驗證。或者可以購買幾種酶的抗體進(jìn)行RIP實驗后，對富集到的RNA進(jìn)行分析挖掘，找到幾種酶有互作的RNA甚至是互作區(qū)域。接下來對特定的motif進(jìn)行突變等實驗進(jìn)行驗證。在這些實驗完成后，如果能發(fā)現(xiàn)一種全新的機(jī)制一般容易沖擊頂級期刊。

 （Zhao B et al. (2017) Nature, 542 (7642): 475）

如上圖所示，何川教授課題組在斑馬魚胚胎發(fā)育期間發(fā)現(xiàn)，如果母源的mRNA不被及時清除，容易在胚胎發(fā)育后期引起合子基因組激活受阻。其中整篇文章最重要、最關(guān)鍵的部分就是YTHDF2在識別帶m6A甲基化修飾的母源mRNA后將其清除。這個現(xiàn)象從一種全新的機(jī)制來闡釋，屬于高度原創(chuàng)的工作，論文被Nature收錄。

 （Lence et al. (2016) Nature, 540(7632):242-247）

再比如在果蠅中，性別分化機(jī)制由Sxl基因來決定。當(dāng)性染色體和常染色體比例為2:2時，sxl基因被激活，從而導(dǎo)致下游的tra基因和msl基因接連被激活，最后果蠅發(fā)育成雌果蠅。當(dāng)甲基化酶被敲除時，Sxl基因m6A修飾發(fā)生變化，從而調(diào)控下游基因的mRNA的剪切，最終雌果蠅壽命受到影響，而雄果蠅則不受影響。這個觀點也屬于首次發(fā)現(xiàn)，所以最終發(fā)表在Nature上。

RNA甲基化如何發(fā)表高分論文，任重而道遠(yuǎn)，愿各位老師能夠早日在理想的雜志上發(fā)表論文。