基因編輯技術(shù)其中一個(gè)強(qiáng)大的應(yīng)用，就是在特定的基因組位點(diǎn)導(dǎo)入核苷酸替換，去模擬與人類疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或者產(chǎn)生終止密碼子以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因敲除。那么，問題來了：應(yīng)該如何從數(shù)以百計(jì)的克隆中篩選出一個(gè)對(duì)單核苷酸進(jìn)行了編輯的細(xì)胞克隆呢？這對(duì)研究人員來說無疑是一個(gè)挑戰(zhàn)，尤其是在沒有相應(yīng)的表型的情況下。然而Takara公司推出的Guide-it SNP Screening Kit可以充分滿足這個(gè)需求，讓您在數(shù)百個(gè)細(xì)胞克隆中輕松篩選出發(fā)生了單核苷酸編輯的細(xì)胞克隆。

Guide-it SNP Screening Kit是通過簡便的酶分析法來進(jìn)行檢測的，可以在96孔板中快速識(shí)別出基因編輯后的細(xì)胞克隆。整個(gè)操作流程簡單快速，首先通過PCR擴(kuò)增基因組靶標(biāo)位點(diǎn)，之后使用識(shí)別特定結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后讀取熒光值就可以完成單核苷酸替換檢測。無論所需要檢測的核苷酸替換類型、細(xì)胞克隆的合子型或者靶標(biāo)位點(diǎn)的基因序列如何，都可以使用這個(gè)方法進(jìn)行檢測。

以G>A替換（野生型鳥嘌呤編輯為腺嘌呤）為例，基因編輯后，分離單細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)成為克隆細(xì)胞系，提取其基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物會(huì)與兩條不同的互補(bǔ)寡核苷酸——displacement oligo（綠色）和flap-probe oligo (深/淺紫色)進(jìn)行雜交。根據(jù)基因編輯的結(jié)果，Oligos與PCR產(chǎn)物雜交后會(huì)形成下圖兩種結(jié)構(gòu)中一種。

當(dāng)基因編輯成功發(fā)生時(shí)，雜交產(chǎn)物為double-flap結(jié)構(gòu)，Double-flap結(jié)構(gòu)由Guide-it Flap Detector識(shí)別檢出，Guide-it Flapase核酸酶特異性剪切并釋放出flap，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。當(dāng)沒有發(fā)生基因編輯時(shí)，flap-probe oligo在靶標(biāo)位點(diǎn)不會(huì)形成完全的堿基配對(duì)，會(huì)形成一個(gè)帶有缺口的結(jié)構(gòu)（上面），這個(gè)結(jié)構(gòu)不能被Guide-it Flapase核酸酶剪切，也就不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過這種方式，使用Guide-it SNP Screening Kit檢測熒光信號(hào)就可以確認(rèn)是否發(fā)生了預(yù)期的核苷酸替換。

也許，有人會(huì)問，這種檢測方法是不是有一定的偏好性呢，是否可以檢測所有可能的堿基替換呢？Takara利用Guide-it SNP Screening Kit在多個(gè)人類基因組位點(diǎn)對(duì)核苷酸替換進(jìn)行檢測，樣品是從Coriell研究所獲取的野生型或者發(fā)生了所標(biāo)明的核苷酸替換的純合子來源的基因組DNA，檢測結(jié)果表明，所有的堿基替換均可以成功檢測到，與野生型（橙色）和陰性對(duì)照（灰色）樣品所獲得的熒光信號(hào)相比，發(fā)生了所標(biāo)明的核苷酸替換的純合子（藍(lán)色）樣品產(chǎn)生了強(qiáng)熒光信號(hào)就可以說明這一點(diǎn)。

對(duì)此，Takara科學(xué)家也將這種檢測方法與Sanger測序法進(jìn)行了比較。他們分別使用了Guide-it SNP Screening Kit（柱形圖）和Sanger測序法對(duì)來自于Coriell研究所的SNPs樣品進(jìn)行分析，這些樣品在NCP1或者CFT基因組位點(diǎn)上攜帶了SNPs。Guide-it SNP Screening Kit可以準(zhǔn)確分析確定哪些樣品發(fā)生了單核苷酸替換，這些樣品是純合子還是雜合子。所有檢測結(jié)果與Sanger測序結(jié)果是一致的（Sanger測序結(jié)果顯示在柱形圖下面）。

Guide-it SNP Screening Kit可以與Sanger測序法相媲美，并且，與Sanger測序法相比，Guide-it SNP Screening Kit卻擁有更快的速度，它可以4 hr完成檢測，不用苦苦等待測序結(jié)果。

這樣的檢測方法很簡單，無需進(jìn)行測序也可以輕松檢測出基因組中的單核苷酸替換突變。不論您的研究領(lǐng)域是CRISPR單核苷酸替換編輯還是高通量SNP篩選，Takara公司的Guide-it SNP Screening Kit都可以讓檢測變得簡單起來。

更多詳細(xì)信息請(qǐng)點(diǎn)擊：Guide-it™ SNP Screening Kit