CRISPR/Cas9基因編輯技術的出現徹底改變了生物學領域，也迅速成為許多實驗室的必備工具。這種編輯技術不僅可以用在基因敲除（knockout），也可以用于基因敲入（knockin），也就是在目標位點精確引入一段DNA序列，以便產生特定突變或插入新元件。這是通過DNA雙鏈斷裂后的同源定向修復機制實現的。

大家都知道，在真核細胞中，DNA雙鏈斷裂的修復機制主要有兩種：非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復（HDR）。HDR被認為是更準確的斷裂修復機制，但它需要修復模板的存在，同時要求受損DNA和供體DNA鏈之間具有更高的序列同源性。

也許有人要問：我應該使用哪種修復模板，雙鏈DNA還是單鏈DNA？其實，這取決于您想要實現的修飾。若希望引入較小的修飾，如單點突變或50 bp以下的突變，那么單鏈DNA是個很好的選擇。若希望插入較大的片段，比如熒光蛋白或選擇元件，那么就需要較長的DNA供體。這個供體可以是雙鏈DNA，也可以是單鏈DNA。

不過，需要注意的是，雙鏈DNA存在隨機整合到基因組上的風險，因此在精確的基因編輯上的應用非常有限。相比之下，單鏈DNA隨機整合的風險大大降低，主要是插入Cas9/sgRNA復合物所靶定的位點。此外，單鏈DNA供體模板對細胞的毒性要遠低于雙鏈DNA模板。

盡管單鏈DNA的優點多多，但它的制備難度較大，費用也頗高。以往，人們只能經濟、無誤地合成200 bp以下的單鏈DNA。一旦超過了這個長度，單鏈DNA的合成就變得非常昂貴，也容易出錯。好在，Takara旗下的Clontech品牌近日推出了Guide-it Long ssDNA Strandase Kit，可制備長達5 kb的單鏈DNA寡核苷酸。

這個試劑盒提供了一種簡便的方法來制備CRISPR/Cas9或者其它基因編輯技術的基因敲入實驗修復模板。它選擇地消化降解雙鏈DNA PCR產物的正義鏈（sense strand）或者反義鏈（antisense strand），將其轉化為單鏈DNA。

具體的制備過程如下（圖1）。首先，通過合適的方法（克隆、融合PCR等）制備dsDNA起始模板，dsDNA模板包含與目的插入位點兩側同源的同源臂，模板中間是欲knockin的外源序列。然后，在dsDNA的不同位置上結合磷酸化的引物，制備出兩種不同的dsDNA作為Strandase反應的底物。添加Strandase Mix A，開始消化正義鏈或反義鏈。接著，添加Strandase Mix B完成降解反應，從而獲得ssDNA。最后，純化ssDNA產物用于knockin實驗。Clontech專家建議，同時制備ssDNA正義鏈和反義鏈并獨立用于knockin實驗。

 
圖1. 長單鏈DNA（long ssDNA）供體模板制備步驟示意圖。

至于ssDNA作為修復模板，效果如何，是否隨機整合？研究人員也給出了詳細的答案。他們打算在HEK293細胞的GAPDH的C-末端定點敲入AcGFP1基因（圖2）。于是，他們設計的HDR供體模板的同源臂序列為GAPDH第8外顯子的末端序列，AcGFP1與GAPDH處于同一閱讀框（圖A）。之后，他們通過流式細胞術比較了dsDNA和ssDNA分別作為修復模板的實驗結果（圖B）。

結果顯示，以dsDNA作為修復模板時，即使沒有Cas9 RNPs，仍然出現相當多的帶有綠色熒光的細胞克隆。然而，以長ssDNA正義鏈或反義鏈作為修復模板時，只有同時加入Cas9和sgRNA，才會發生整合反應；而沒有Cas9 RNPs時，則沒有檢測到熒光背景，說明不發生整合反應。如此看來，ssDNA隨機整合的風險的確大大降低。

 
圖2. 在HEK293細胞的GAPDH的C-末端定點敲入AcGFP1基因。

此外，研究人員還比較了在knockin實驗中導入dsDNA和ssDNA所產生的細胞毒性。他們使用Cellartis hiPSC18細胞系。插入序列為AcGFP1，其作用是用于標記tubulin。結果顯示，即使沒有加入Cas9，dsDNA的導入仍然可以引起顯著的細胞毒性。

 
圖3. 比較knockin實驗中導入dsDNA和ssDNA所產生的細胞毒性。

現在，您可以輕松愉快地制備ssDNA修復模板了吧，既不用擔心dsDNA的隨機整合，也無需憂慮dsDNA所帶來的細胞毒性。之后，ssDNA可通過電穿孔或試劑轉染的方法導入細胞，具體要取決于您研究的細胞類型。

對于電穿孔方法，同時導入細胞的還有sgRNA（利用Guide-it sgRNA體外轉錄試劑盒制備）以及Guide-it Recombinant Cas9。至于傳統的轉染實驗，您可以選擇同時表達Cas9和sgRNA的一體化表達載體，比如Guide-it CRISPR/Cas9 System，與ssDNA共轉染。高大上的knockin實驗，就是這么簡單！（生物通 余亮）

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