福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)方法保存固體組織可以準(zhǔn)確地保存組織形態(tài)，常為臨床病理學(xué)家所采用。估計(jì)世界范圍內(nèi)有> 10億的 FFPE樣本，是目前疾病分子層面及臨床研究的重要樣本來(lái)源，因而十分珍貴。不過(guò)由于FFPE樣品保存過(guò)程中核酸已經(jīng)部分降解了，且DNA往往與組蛋白緊密交聯(lián)，因而很難獲得足量和高質(zhì)量的DNA。

傳統(tǒng)的FFPE核酸抽提方法主要是通過(guò)二甲苯或礦物油進(jìn)行被動(dòng)擴(kuò)散脫蠟，多種有機(jī)溶劑/水孵育進(jìn)行組織被動(dòng)復(fù)水，組織勻漿，蛋白酶處理進(jìn)行組織消化解交聯(lián)，*后用苯酚氯仿或硅膠模過(guò)柱或磁珠法進(jìn)行DNA的抽提純化。目前市面上較多FFPE提取試劑盒都屬于這一類(lèi)傳統(tǒng)方法，不過(guò)都或多或少進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，如Qiagen 提供了新型脫蠟液，加入脫蠟溶液后無(wú)需沉淀FFPE樣品和去除含有石蠟的上清，減少了樣品損失，并縮短了蛋白酶K孵育的時(shí)間。

除了這一類(lèi)傳統(tǒng)常規(guī)FFPE核酸抽提方法，Covaris 基于**自動(dòng)聚焦聲波技術(shù)（Adaptive Focused Acoustics， AFA）的方法也值得關(guān)注。Covaris truXTRAC™ FFPE核酸抽提主要通過(guò)精準(zhǔn)控制的聚焦聲波能量對(duì)FFPE樣本進(jìn)行脫蠟再水化和組織消化、解交聯(lián)、核酸釋放和純化。通過(guò)超聲乳化、脫蠟：提高樣本水化效果和生物大分子解離，告別二甲苯等有機(jī)溶劑由于脫蠟效率和試劑殘留可能造成的對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的干擾，從樣本到可用于NGS等下游應(yīng)用的核酸，整個(gè)過(guò)程僅需不到3小時(shí)，同時(shí)多數(shù)傳統(tǒng)的脫蠟方法僅可處理5-10 μm厚的組織切片，但Covaris方法可處理5-25μm厚的FFPE組織切片。

那么這兩大類(lèi)型方法，究竟哪一類(lèi)方法更適合分子診斷層面的需求呢？美國(guó)Roswell Park 癌癥研究所Personalized Medicine中心的研究人員對(duì)二者抽提的核酸樣本在各大主流測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行了驗(yàn)證比較。
研究人員在研究肺癌FFPE樣本時(shí)對(duì)于Qiagen的硅膠模過(guò)柱法和Covaris的AFA方法進(jìn)行了一系列包括DNA得率、質(zhì)量以及兩者抽提的核酸進(jìn)行后續(xù)NGS建庫(kù)選取如下肺癌常見(jiàn)檢測(cè)基因（見(jiàn)Table1）檢測(cè)SNV、插入缺失、拷貝數(shù)變異等，進(jìn)行了一系列的比較。

研究者選取了8種類(lèi)型癌組織FFPE樣本，包括肺癌，用14 gauge大小的解剖針取樣，同一樣本上的取下的兩個(gè)core，分別用Covaris truXtract FFPE DNA isolation和QIAGEN DNeasy tissue kit方法提取核酸。用Qubit and NanoDrop檢測(cè)得到DNA量和純度，2100 BioAnalyzer預(yù)估片段大小。另一邊選取6個(gè)肺癌組織，相同方法分別取樣后同樣分別用兩種方法提取DNA。用焦磷酸測(cè)序 (PyroMark)、Ion AmpliSeq PGM和Illumina (MiSeq)NGS二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行突變分析，用NanoString nCounter system分析拷貝數(shù)變異。Covaris組DNA樣品額外進(jìn)行了1:2和1:4的稀釋處理。

結(jié)果：Covaris提取的DNA樣本得率和片段長(zhǎng)度大多數(shù)優(yōu)于Qiagen提取的。Covaris truXtrac DNA 樣本在進(jìn)一步的分子診斷測(cè)試中也表現(xiàn)的更優(yōu)。尤其是在MiSeq NGS平臺(tái)，提高了簇密度和覆蓋度；Nanostring nCounter 要求的片段長(zhǎng)度比PGM還要長(zhǎng)，Covaris truXtrac DNA樣本組提高了在nCounter上的count。（見(jiàn)Table2和Figure2）。

研究者*后得出結(jié)論與Qiagen提取相比Covaris truXtract isolation kit為肺癌FFPE樣本提供了一個(gè)良好提取高質(zhì)量DNA的解決方案，包括DNA得率和片段大小，預(yù)示著即使更小的組織切片也可以收集和提取來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的分子診斷。此外，Covaris提取的DNA在NGS測(cè)序平臺(tái)上可以減少25-50%而不影響實(shí)驗(yàn)。

難怪主流測(cè)序平臺(tái)公司如三代單分子測(cè)序Pacbio、Illumina旗下Lucigen（原Epicentre）等在處理FFPE樣本時(shí)，均推薦Covaris truXtract。此外，DNA片段化也可同時(shí)在truXTRAC流程中完成，簡(jiǎn)化了測(cè)序文庫(kù)制備的流程。

Covaris truXtrct FFPE DNA/RNA試劑盒在Covaris 各型號(hào)平臺(tái)上均可使用，試劑成本目錄價(jià)約￥170/樣。如果您已經(jīng)有Covaris平臺(tái)，除了核酸片段化，還可以拓展它例如FFPE樣本核酸提取、Chip染色質(zhì)剪切等應(yīng)用。如果您暫未有Covaris平臺(tái)，又面臨FFPE核酸樣本抽提質(zhì)量不高的問(wèn)題，請(qǐng)聯(lián)系我們，我們可以為您介紹您身邊的Covaris平臺(tái)。

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參考文獻(xiàn):Jeffrey Conroy, Hanchun T. DeFedericis ,et al.DNA Extraction of Lung Cancer Samples for Advanced Diagnostic Testing[J]. OminiSeq Precision Medicine Technology,2016,Sept 9th.