Olaf Scheibner, Maciej Bromirski, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
 
關鍵詞
Q Exactive Focus，Orbitrap，獸藥，HRAM定量，HRAM篩查，vDIA，未知物篩查，回顧性數據分析

目的
本實驗利用可變數據非依賴采集（vDIA），建立了一種獸藥分析的新方法。該法具備高靈敏度和高選擇性，能夠獲得被測樣品全面而高質量的數據，并可將定量分析與非目標物和未知物篩查相結合。

引言
考慮到樣品預處理和質譜分析的復雜性，動物源食品中的獸藥殘留分析通常是一個費時的過程。利用傳統方法對動物源食品（包括肉、奶和血漿）中多類獸藥殘留進行定量分析，常常需要多次進樣以獲得各類成分的最佳分析條件，包括針對不同種類化合物而開發的不同色譜和質譜方法。并且所獲數據僅僅包含目標化合物的信息，而不適用于其它化合物的回顧性分析。

本實驗使用超快速液相色譜和Thermo ScientificTM Q Exactive FocusTM臺式 OrbitrapTM質譜聯用系統建立了一種新方法，其包含快速色譜方法和可變數據非依賴采集（vDIA）質譜方法。該法具有總分析時間短、選擇性高和靈敏度高等優點，并且其采集的數據能夠用于其它目標物和非目標物篩查。本實驗利用vDIA方法制作標準曲線，并對樣品中已知和未知目標化合物進行分析。vDIA允許設置多個MS/MS隔離窗口，窗口寬度可從50Da到800Da。通常較小的窗口寬度用于低質量區域以擴展動態范圍和提高靈敏度，較大的窗口寬度用于更高質量區域以改善工作周期。該法的典型方法設置如本文所示，用5組MS/MS隔離窗口覆蓋全掃描的整個質量數范圍，同時保持MS/MS分析速度與快速色譜分離相匹配。

如表1所示，分析成分為44個不同種類的獸藥殘留，分析樣品包括肌肉、腎臟、牛奶和血漿提取物，所有樣品均采用相同的標準化色譜和質譜方法進行分析。為了進行絕對定量分析，44個濃度已知的獸殘標準品被配制成8個不同濃度的標準品溶液（從100pg/mL （ppt）到500ng/mL （ppb））。采用高分辨、高質量精度的（HRAM）LC-MS/MS方法，分析基質加標樣品（肌肉和腎臟中加入抗生素標樣、牛奶中加入阿維菌素類標樣、血漿中加入硝酸咪唑類標樣）以評價方法。

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表1  目標化合物及其定量限（LOQ）

化合物 LOQ(ppb)  化合物 LOQ(ppb)
阿維菌素 5.0  馬波沙星 5.0
阿莫西林 1.0  甲硝唑 0.5
氨芐西林 0.5  羥基甲硝唑 0.5
頭孢氨芐 0.5  莫西菌素 0.5
頭孢洛寧 0.5  奈夫西林 0.5
氧呱羥苯唑頭孢菌素 1.0  苯唑西林 0.1
Cefapirim   0.1  青霉素G 0.5
頭孢喹肟 5.0  青霉素V 0.5
氯四環素 1.0  洛硝噠唑 0.5
環丙沙星 0.5  鹽酸沙拉沙星 0.5
氯灑西林 0.1  磺胺嘧啶 0.1
達氟沙星 5.0  磺胺二甲氧基嘧啶 0.5
氨苯砜 0.5  磺胺二甲嘧啶 0.1
二氟沙星 0.5  磺胺多辛 0.5
二甲硝咪哇 5.0  磺胺甲基嘧啶  0.1
多拉菌素 10.0  磺胺甲惡唑 0.5
多西環素 0.5  磺胺甲氧吡噠嗪 0.1
恩諾沙星 1.0  磺胺塞唑 0.5
埃普利諾 5.0  四環素 0.5
紅霉素 1.0  硫霉素 0.5
氟甲喹 1.0  甲氧芐氨嘧啶 0.5
羥基異丙硝唑 0.5  泰樂菌素 1.0

實驗方法

液相色譜方法
所有樣品均采用以下液相色譜方法：

質譜分析方法
質譜方法采用全掃描和寬隔離窗口的可變數據非依賴采集(FS-vDIA)方法：

數據處理方法
使用Thermo ScientificTM TraceFinderTM 3.2版軟件進行數據處理。提取離子流色譜圖采用5ppm的提取窗口。為了進行非目標篩查，使用一個包括450種組分的數據庫，該庫中內置了各種組分及其碎片m/z值。

分析物的定量基于全掃描信息（準分子離子）。另外，根據歐盟的法規要求（EC/657/2002），1至5個碎片離子用于定性確認，在上述濃度范圍內獲得線性標準曲線。

結果和討論

本文介紹的vDIA方法能夠將全掃描數據依賴MS2（FS-ddMS2）和全范圍碎片掃描模式（比如全部離子碎裂AIF模式）二者有機結合起來。如圖2所示，其將一個全掃描和數個寬范圍隔離窗口的MS2掃描相結合。在此設置中，MS2隔離窗的寬度從100Da到500Da不等，幾個隔離窗口共同覆蓋了先前全掃描的整個質量范圍。

FS-ddMS2方法的MS2掃描是對全掃描中檢出的目標化合物（在母離子列表中）進行MS2掃描，其獲得的碎片離子信息具有很高的選擇性和靈敏度。對于其它關注的化合物，由于缺乏MS/MS定性確認，FS-ddMS2方法的回顧性數據分析僅基于精確質量數的全掃描定量。

全范圍碎片掃描模式如AIF，其全掃描中所有化合物的碎片都在一次MS2掃描中檢測，其優勢在于可以采集樣品中所有可能的全掃描和MS2掃描信息，因此，該方法尤其適用于回顧性數據分析。但是由于分析物本身的復雜性，導致每種化合物的碎片離子數量有限，因此，該方法的動態范圍、選擇性和檢出限等方面存在一定局限性。

在vDIA方法中，碎片離子分布在多個寬范圍隔離窗口中，這些窗口覆蓋了完整的質量數范圍。該方法具備相當高的靈敏度和選擇性，同時保持了樣品信息的完整性，因而非常適用于回顧性數據分析。表1中的定量限（LOQs）是以逐級稀釋法進行全掃描定量并結合碎片離子定性確證得出的。定量限此處定義為，至少能以一個碎片離子進行定性確證的最低化合物濃度。

對于準確定量和定性確認，用于定性確證的碎片離子需在保留時間和質量數兩方面均能充分分辨，以免受到升高的背景或干擾峰的影響。圖3舉例說明，使用vDIA掃描模式和TraceFinder軟件自動化處理所提取的定性碎片離子（右邊面板）與定量母離子的離子色譜圖重疊度和匹配度均很高。所有的定性離子不受干擾，且和定量離子同時流出，使定性結論毋庸置疑，這點對于復雜基質樣品的分析特別重要。在vDIA模式下，能得到所有共流出碎片的輪廓圖，因此通過碎片色譜峰積分并計算碎片離子比，也能夠對定性結果進行更可靠的確證。
 
對于阿維菌素和多拉菌素，實驗發現準分子離子穩定性不好，因此全掃描檢測的靈敏度不高。這種不穩定性可能是由于采用了該通用方法的平均參數。在這種情況下，vDIA方法可以選用阿維菌素和多拉菌素的幾個碎片離子進行定量，在這種模式下，相比全掃描模式而言，即使離子濃度遠遠低于準分子離子濃度，也能夠完成可靠的定量和定性確認。

建立了定量曲線后，對低濃度基質加標樣品中所有組分進行定量分析。肌肉和腎臟樣品中加入5ppb抗生素，牛奶中加入1.0ppb阿維菌素，血漿中加入1.0ppb硝基咪唑類獸藥。

在以保留時間進行全掃描識別的分析中，TraceFinder處理軟件為組分檢測提供很高的選擇性（使用 5 ppm的窄提取窗口）。該軟件還提供另外三種自動定性確證方式。第一種方式是通過全掃描中母離子的同位素信息進行確證。圖5為環丙沙星實測（紅色）和理論（藍色）的同位素分布疊加圖。將分辨率設定為70,000，即使在如肌肉提取物的復雜基質中，某個化合物的濃度低至5ppb，其同位素分布的匹配仍不受干擾，確保了定性結果的可靠性。

第二種方式是通過MS/MS數據檢測已知碎片離子進行定性確證。以下結果為0.5ppb肌肉組織加標樣的檢測結果。圖6為vDIA模式下碎片離子確證的結果。由于vDIA譜圖采用一個寬隔離窗口生成，因此可以檢測多個母離子產生的碎片離子。Orbitrap MS/MS具備的高分辨率和高質量精度特性，使得碎片離子的選擇性識別成為可能，結合保留時間，可獲得可靠的確證結果。

大多數常規方法能夠分析的目標化合物數量有限。因此，對候選藥物進行“后質譜分析”的再分析能力，有利于節省儀器/實驗時間和樣品。為了演示數據文件的回顧性分析，對肌肉組織加標樣品的vDIA數據文件進行寬范圍篩查。利用內置的1500種化合物數據庫進行未知物篩查，結果發現，數據庫中的部分結果與樣品中出現的其他組分高度匹配。圖7以皮質醇（氫化可的松）為例，展示了通過同位素匹配、碎片搜索和譜庫匹配得到的確證結果。

結論
本文利用Q Exactive Focus MS和UltiMate 3000 HPLC，建立了用于44個不同種類獸藥殘留篩查定量的可變數據非依賴采集方法。該新方法滿足所需的LOD靈敏度，并且能夠根據保留時間、精確m/z、同位素比和碎片離子等進行定性確認，性能優于歐盟的法規要求（EC/657/2002）。vDIA為非目標化合物和未知物的篩查確證提供了一種新方法，具備高靈敏度和高選擇性。TraceFinder軟件簡單易用，可應用在化合物識別和定性確證的全過程。vDIA方法達到了預期目標，能夠準確而靈敏地檢測非目標化合物（例如，44種組分列表中的物質），并能對未知化合物進行回顧性分析篩查。