什么是均一化呢？

Western Blot均一化是指：將目標(biāo)蛋白信號(hào)÷上樣對(duì)照信號(hào)得到均一化的數(shù)據(jù)，以此來校正不同樣本之間、不同泳道之間的差異，以獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)的Western Blot的結(jié)果。上樣對(duì)照一般是穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參蛋白，表達(dá)量不受環(huán)境、實(shí)驗(yàn)處理的影響。

均一化校正的是什么呢？

為什么要進(jìn)行均一化呢？

均一化校正了樣本之間的差異，保證了Western Blot檢測(cè)到的數(shù)據(jù)是目標(biāo)蛋白真實(shí)的數(shù)據(jù)。如果沒有進(jìn)行合適的均一化，不能確保獲取的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是真實(shí)的生物學(xué)差異還是實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致的誤差（如圖一所示）。

圖一：均一化校正了樣本之間的差異，保證了Western Blot 檢測(cè)到的數(shù)據(jù)是真實(shí)的生物差異而不是實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致的誤差。A圖：未進(jìn)行均一化的數(shù)據(jù)顯示目標(biāo)蛋白（紅色）表達(dá)量差異較大，樣本四表達(dá)量*低；B圖：經(jīng)內(nèi)參蛋白（綠色）均一化后數(shù)據(jù)顯示，樣本之間蛋白表達(dá)量差異很小。

有哪些均一化方法呢？

比較經(jīng)典的方法是用看家蛋白做內(nèi)參進(jìn)行均一化，看家蛋白又稱管家蛋白，一般被認(rèn)為在所有的組織中表達(dá)恒定且不受實(shí)驗(yàn)條件的影響，主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等，但是進(jìn)一步的研究表明，在某些實(shí)驗(yàn)條件下，看家基因的表達(dá)會(huì)因不同類型的組織、不同的發(fā)育階段、或不同的實(shí)驗(yàn)條件而變化。另外，用看家蛋白進(jìn)行均一化需要注意信號(hào)飽和的問題，因?yàn)橐话闱闆r下看家基因表達(dá)豐度相對(duì)于目標(biāo)蛋白豐度較高，兩種蛋白可能存在不同的線性范圍，為此實(shí)驗(yàn)人員往往需要調(diào)整上樣量。因此為了確保更準(zhǔn)確、客觀的的均一化方法，有些研究人員、期刊雜志建議用總蛋白做Western Blot的均一化。

總蛋白染色---REVERT™ Total Protein Stain

總蛋白均一化是利用染料對(duì)膠上/膜上的總蛋白染色進(jìn)行均一化，主要包括以下幾種類型：不可逆結(jié)合染料法：如考馬斯亮藍(lán)染色法、Stain Free法等；可逆結(jié)合染料法：REVERT™ Total Protein Stain總蛋白染色法�？捡R斯亮藍(lán)染色法操作簡單但往往需要同時(shí)跑兩塊膠，一塊膠進(jìn)行染色另一塊膠進(jìn)行后續(xù)免疫試驗(yàn)，因?yàn)槭菍?duì)膠進(jìn)行染色所以存在不能校正轉(zhuǎn)印差異的問題；Stain Free等染料不可逆共價(jià)結(jié)合蛋白法，是對(duì)膠上或膜上總蛋白進(jìn)行染色，由于與蛋白是共價(jià)不可逆結(jié)合，因此可能會(huì)影響抗體與靶蛋白的結(jié)合，并且在膜上的背景較高、線性范圍也比較窄；LI-COR REVERT™ Total Protein Stain方法是對(duì)膜上總蛋白進(jìn)行染色，因?yàn)槭强赡娼Y(jié)合所以不會(huì)影響后續(xù)抗體結(jié)合，不干擾Western Blot的檢測(cè)，而且是在近紅外波段成像背景較低，靈敏度較高，因此能夠校正Western Blot的所有步驟，適用于任何生物條件下的實(shí)驗(yàn)，成像結(jié)果見圖二。

哪種均一化方法*好？

沒有哪一種均一化方法是*好的，因此需要了解每一種方法的特點(diǎn)以便選擇一種符合您實(shí)驗(yàn)?zāi)康�、生物學(xué)條件的均一化方法，以校正不同樣本之間的差異，帶給您準(zhǔn)確、可重復(fù)、可發(fā)表的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。無論您選用哪種均一化方法，LI-COR Odyssey 近紅外激光成像系統(tǒng)都能提供準(zhǔn)確的結(jié)果。

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