什么是均一化呢？

Western Blot均一化是指：將目標蛋白信號÷上樣對照信號得到均一化的數據，以此來校正不同樣本之間、不同泳道之間的差異，以獲得準確、可重復的Western Blot的結果。上樣對照一般是穩定表達的內參蛋白，表達量不受環境、實驗處理的影響。

均一化校正的是什么呢？

為什么要進行均一化呢？

均一化校正了樣本之間的差異，保證了Western Blot檢測到的數據是目標蛋白真實的數據。如果沒有進行合適的均一化，不能確保獲取的實驗數據是真實的生物學差異還是實驗導致的誤差（如圖一所示）。

圖一：均一化校正了樣本之間的差異，保證了Western Blot 檢測到的數據是真實的生物差異而不是實驗導致的誤差。A圖：未進行均一化的數據顯示目標蛋白（紅色）表達量差異較大，樣本四表達量*低；B圖：經內參蛋白（綠色）均一化后數據顯示，樣本之間蛋白表達量差異很小。

有哪些均一化方法呢？

比較經典的方法是用看家蛋白做內參進行均一化，看家蛋白又稱管家蛋白，一般被認為在所有的組織中表達恒定且不受實驗條件的影響，主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等，但是進一步的研究表明，在某些實驗條件下，看家基因的表達會因不同類型的組織、不同的發育階段、或不同的實驗條件而變化。另外，用看家蛋白進行均一化需要注意信號飽和的問題，因為一般情況下看家基因表達豐度相對于目標蛋白豐度較高，兩種蛋白可能存在不同的線性范圍，為此實驗人員往往需要調整上樣量。因此為了確保更準確、客觀的的均一化方法，有些研究人員、期刊雜志建議用總蛋白做Western Blot的均一化。

總蛋白染色---REVERT™ Total Protein Stain

總蛋白均一化是利用染料對膠上/膜上的總蛋白染色進行均一化，主要包括以下幾種類型：不可逆結合染料法：如考馬斯亮藍染色法、Stain Free法等；可逆結合染料法：REVERT™ Total Protein Stain總蛋白染色法。考馬斯亮藍染色法操作簡單但往往需要同時跑兩塊膠，一塊膠進行染色另一塊膠進行后續免疫試驗，因為是對膠進行染色所以存在不能校正轉印差異的問題；Stain Free等染料不可逆共價結合蛋白法，是對膠上或膜上總蛋白進行染色，由于與蛋白是共價不可逆結合，因此可能會影響抗體與靶蛋白的結合，并且在膜上的背景較高、線性范圍也比較窄；LI-COR REVERT™ Total Protein Stain方法是對膜上總蛋白進行染色，因為是可逆結合所以不會影響后續抗體結合，不干擾Western Blot的檢測，而且是在近紅外波段成像背景較低，靈敏度較高，因此能夠校正Western Blot的所有步驟，適用于任何生物條件下的實驗，成像結果見圖二。

哪種均一化方法*好？

沒有哪一種均一化方法是*好的，因此需要了解每一種方法的特點以便選擇一種符合您實驗目的、生物學條件的均一化方法，以校正不同樣本之間的差異，帶給您準確、可重復、可發表的高質量數據。無論您選用哪種均一化方法，LI-COR Odyssey 近紅外激光成像系統都能提供準確的結果。

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