近年來，新一代測序（NGS）技術蓬勃發展，也實現了許多激動人心的應用。然而，盡管NGS技術在不斷改進，但文庫制備仍然是整個流程中最大的瓶頸之一。它有許多值得吐槽的地方，比如步驟多，耗時長，樣品有可能損失，也有可能引入操作誤差。

一般來說，文庫制備的流程包括DNA片段化、末端修復、加A尾、接頭連接，然后是回收和大小選擇。當然，這中間還穿插著許多純化的步驟。對于珍貴樣品或高通量操作而言，這顯然是一場噩夢。然而，文庫的質量與測序結果息息相關。

第一步的DNA片段化就不能掉以輕心。在這一步中，人們通常利用物理方法（如超聲剪切）或酶學方法（即非特異的核酸內切酶處理）將DNA被剪切成小片段。均一的DNA片段化是關鍵，可幫助獲得最佳的文庫產量和重復的測序結果。

許多實驗室采用Covaris的儀器進行超聲剪切。在2015年的ASHG年會上，約翰霍普金斯大學的研究人員發布了一張很有意思的海報。他們評估了兩種DNA片段化策略對整體測序結果的影響。在實驗中，他們比較了Covaris方法和另一種酶切方法。

他們發現，即使Covaris的DNA片段化帶來了一致的結果，但它并不適合高通量的DNA片段化。在Covaris方法中，樣品被連續處理，96個樣品大約需要10個小時，拉長了整個測序流程。除了時間，這種方法也需要專門的設備和處理管，增加了整體費用。作者總結道，用酶切的方法來取代Covaris，并不會影響測序結果。

既然效果相當，那么酶切的方法顯然更加簡單易行。QIAGEN最近就推出了QIAseq FX，一個基于酶切片段化的快速NGS文庫制備系統，能夠在2.5小時內從DNA中獲得可立即測序的文庫。它省去了各個步驟之間的磁珠純化步驟，可以節省相當多的時間。另外，方便的多孔板形式和96重的Illumina接頭降低了交叉污染的風險，讓自動化輕松實現。

這個試劑盒采用FX酶混合液將DNA樣品剪切為較小的片段，并開展末端修復，在3’端加A尾，讓DNA片段可立即用于連接。它適用于10-1000 ng的起始DNA。若DNA少于10 ng，也不要緊，加入FX Enhancer即可。通過改變QIAseq FX的片段化反應條件可調整片段大小，而具體大小取決于應用和測序讀長。整個過程大約在1小時內完成，期間不需要任何純化步驟。

在這一步之后，測序平臺特異的接頭可與DNA片段的兩端連接。QIAseq FX DNA Library Kit中提供了96重的Illumina 接頭板（Adapter Plate）。每孔包含一次性的接頭，還帶有2個8核苷酸的識別條形碼。將8種D5條形碼和12種D7條形碼組合起來，這個試劑盒支持了96重測序。

如果你的起始材料比較少（< 100 ng），可利用試劑盒中的試劑，開展高保真的擴增步驟。HiFi PCR Master Mix能夠均一擴增GC含量迥異的DNA區域，最大限度降低PCR引起的測序偏向，確保在后續的測序實驗中獲得準確結果。

如今，即使沒有專門的設備，只要有了QIAseq FX，也能實現快速、高效的文庫制備了。你，是不是也想試試？（生物通 余亮）

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