目前，NGS技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于人類T細(xì)胞受體（TCR）多樣性的研究。不過(guò)，在利用傳統(tǒng)方法生成TCR測(cè)序文庫(kù)時(shí)，往往只包含TCR可變區(qū)的一部分，而且需要用到復(fù)雜的多重PCR策略。為此，Takara旗下Clontech近日推出了一個(gè)新的解決方案。

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit為那些利用NGS開展TCR免疫組庫(kù)分析的研究人員帶來(lái)了一個(gè)強(qiáng)大的方案。它以RNA樣本或淋巴細(xì)胞作為起始材料，采用類似5’ RACE的策略來(lái)捕獲TCR轉(zhuǎn)錄本中完整的V(D)J可變區(qū)。

這個(gè)試劑盒接受的RNA起始量很廣泛。有研究表明，從外周血白細(xì)胞中獲得的10 ng至3 μg RNA可產(chǎn)生高質(zhì)量的測(cè)序文庫(kù)。您甚至可以直接從完整的淋巴細(xì)胞開始，用50至10,000個(gè)純化的T細(xì)胞制備文庫(kù)。

顧名思義，這個(gè)試劑盒能夠產(chǎn)生TCR-α和TCR-β鏈多樣性的數(shù)據(jù)，這些可以單獨(dú)獲得或同時(shí)獲得。與以往的多重PCR方法不同，每一輪的文庫(kù)擴(kuò)增使用一對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增每個(gè)TCR亞基。制備好的文庫(kù)已經(jīng)帶有索引，可立即在Illumina平臺(tái)上測(cè)序。

SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit利用了Clontech成熟的SMART技術(shù)以及Exiqon公司的LNA技術(shù)，以無(wú)偏向的方式擴(kuò)增TCR的mRNA序列。首先開展第一鏈cDNA合成，在合成鏈的3’端添加一些非模板的核苷酸。之后，SMART-Seq v4 Oligonucleotide與這些核苷酸退火，并作為模板，在第一鏈cDNA上摻入更多的核苷酸。這也就是模板轉(zhuǎn)換的步驟。摻入的核苷酸，又稱為“SMART序列”，將作為后續(xù)PCR的引物退火位點(diǎn)，保證只有全長(zhǎng)的cDNA經(jīng)過(guò)擴(kuò)增。

之后是兩輪PCR，擴(kuò)增TCR-α和TCR-β可變區(qū)所對(duì)應(yīng)的cDNA序列。第一輪的正向引物與SMART序列互補(bǔ)，而反向引物則有兩個(gè)，分別對(duì)應(yīng)TCR-α和TCR-β，若需要分析兩個(gè)TCR亞基，則可同時(shí)加入。第二輪PCR則以第一輪的產(chǎn)物為模板，利用半巢式引物擴(kuò)增整個(gè)可變區(qū)和部分恒定區(qū)。在PCR后，經(jīng)過(guò)純化、大小選擇和定量，文庫(kù)即可用于測(cè)序。

 
圖1. SMARTer 法文庫(kù)構(gòu)建流程及TCR多樣性分析PCR策略

這個(gè)試劑盒具有出色的靈敏度和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)表明，即使樣品起始量存在差異，它依然能獲得一致的結(jié)果。同時(shí)，它也實(shí)現(xiàn)了低豐度TCR序列的檢測(cè)。在免疫組庫(kù)分析上，它也可以助您一臂之力。

 
圖2 SMART技術(shù)重復(fù)性和靈敏度分析。以PBMC RNA樣品中分別摻入不同濃度（10%，1%，0.1%，0.01%和0.001%）的同源白血病Jurkat T細(xì)胞RNA（TRAV8-4-TRAJ3，TRBV12-3-TRBJ1-2克隆型）為起始，利用SMARTer技術(shù)構(gòu)建文庫(kù)。對(duì)每一個(gè)混合文庫(kù)測(cè)序獲得的TRBV12-3-TRBJ1-2相關(guān)的讀段數(shù)量通過(guò)扣除陰性對(duì)照（PMBC RNA）的讀段數(shù)進(jìn)行均一化處理。分析表明，SMARTer技術(shù)構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)對(duì)不同豐度的特定TCR克隆型的分析是可信、可重復(fù)的（Panel A）。利用SMARTer技術(shù)構(gòu)建文庫(kù)，可以對(duì)摻入量為0.1%的Jurkat RNA進(jìn)行有效測(cè)序，證明了SMARTer技術(shù)的靈敏性（Panel B）。

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