生物通報道：新一代測序技術在爆炸式發展的同時，也衍生出許多其他技術創新。RNA深度測序（RNA-Seq）就是其中之一，這項技術使我們對細胞發育及其調控機制的理解，達到了前所未有的深度和廣度。盡管研究細胞RNA并不是什么新鮮事，但RNA-Seq的出現大大拓展了轉錄組研究的規模，取得了累累碩果，這些是傳統技術難以企及的。

RNA-seq可以獲得相當驚人的數據量，而這恰恰是一柄雙刃劍。豐富的數據量蘊含著大量的寶貴信息，但這樣的數據需要復雜的生物信息學分析，才能從中提取到有意義的結果。正因如此，數據分析可以說是RNA-seq的重中之重。

RNA-seq有非常廣泛的應用，但沒有哪個分析軟件是萬能的。科學家們一般會根據自己的研究對象和研究目標，采用不同的數據分析策略。現在人們已經發表了大量的RNA-seq和數據分析方案，對于剛入門的新手來說難免有些無所適從。

佛羅里達大學、加州大學Irvine分校等單位的研究人員在一月二十六日的Genome Biology雜志上發表文章，概述了RNA-seq生物信息學分析的現行標準和現有資源，為人們提供了一份帶有注釋的RNA-seq數據分析指南。這將成為開展RNA-seq研究的寶貴參考資料。

這份指南覆蓋了RNA-seq數據分析的所有主要步驟，比如質量控制、讀段比對、基因和轉錄本定量、差異性基因表達、功能分析、基因融合檢測、eQTL圖譜分析等等。研究人員繪制的RNA-seq分析通用路線圖（標準Illumina測序），將主要分析步驟分為前期分析、核心分析和高級分析三類。前期預處理包括實驗設計、測序設計和質量控制。核心分析包括轉錄組圖譜分析、差異基因表達和功能分析。高級分析包括可視化、其他RNA-seq技術和數據整合。

研究人員在文章中探討了每個步驟所面臨的挑戰，也評估了一些數據處理方法的潛力和局限。此外，他們還介紹了RNA-seq數據與其他數據類型的整合。這種數據整合可以將基因表達調控與分子生理學和功能基因組學關聯起來，如今越來越受到研究者的歡迎。

這篇文章在結尾處介紹了一些為轉錄組領域帶來改變的新技術，特別是單細胞RNA-seq和長讀取測序技術帶來的機遇和挑戰。

2015年年初，RNA-Seq的數據分析方法如雨后春筍般涌現。三月份，Nature集團旗下刊物發表了三篇介紹RNA-Seq數據分析新方法的文章，一篇發表在《Nature Methods》上，另外兩篇發表在《Nature Biotechnology》上。這三篇文章有一位共同的作者，那就是約翰霍普金斯大學計算生物學中心的Steven Salzberg，生物信息學和計算生物學領域的杰出科學家。Salzberg通過這些文章中分別介紹了三種新工具：HISAT、StringTie和Ballgown。這些工具可以取代之前開發的早期工具，為RNA-Seq提供了全新的數據分析方法，從原始數據讀取到差異表達分析。（更多詳細信息參見：三篇文章介紹RNA-Seq數據分析的新工具）

RNA測序究竟有多可靠呢？由美國FDA牽頭的測序質量控制（SEQC）項目對RNA測序的準確性、可重現性和信息含量進行了綜合性評估。其初步調查結果發表在2014年09月的Nature Biotechnology雜志上，石樂明教授是這篇文章的通訊作者之一。研究人員用RNA參照樣本在全球多個實驗室的Illumina HiSeq、Life Technologies SOLiD、Roche 454平臺上進行檢測，主要評估RNA測序在接頭區域和差異性表達譜中的表現，并將其與芯片和定量PCR（qPCR）進行比較。研究表明，數據分析的算法會對RNA測序產生很大影響，不同算法生成的轉錄本數據存在很大差異。（更多詳細信息參見：石樂明教授Nature子刊：RNA測序到底可不可靠）

前幾天，浙江大學和哈佛大學的研究人員在Cell Reports雜志上發表了一項單細胞mRNA-seq研究。基因表達變異是小鼠胚胎干細胞（ESC）的一個重要特征，但人們一直不清楚這背后的具體原因。研究人員通過分析小鼠胚胎干細胞發現，這些細胞表現出的異質性是血清培養造成的。他們在其中鑒定了高度變異的基因簇，以及獨特的染色質狀態。研究顯示，雙價基因（bivalent gene）更容易出現表達變異。進一步研究表明，無血清培養可以減少小鼠ESC的異質性和轉錄組變異。這意味著，細胞內的網絡變異大多是細胞外的培養環境造成的。（更多詳細信息參見：浙大80后教授發表單細胞RNA測序研究）

生物通編輯：葉予

生物通推薦原文：A survey of best practices for RNA-seq data analysis