之前，外泌體（exosome）及其他細(xì)胞外囊泡（EV）一直是不起眼的灰姑娘，而最近診斷和治療潛力的發(fā)現(xiàn)，仿佛給這些小囊泡穿上了水晶鞋，使其一晃變成光彩奪目的公主。

眾所周知，細(xì)胞不斷向細(xì)胞外空間分泌大量的小囊泡。這些小囊泡的直徑大多為50-200 nm，脂雙層結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)了細(xì)胞間的運(yùn)輸。至于運(yùn)輸了什么，人們沒(méi)有太在意，大抵是一些不重要的蛋白吧。直到最近，人們才發(fā)現(xiàn)他們錯(cuò)了。exosome及其他細(xì)胞外囊泡正起著不可缺少的細(xì)胞通訊作用。

小囊泡，大潛力

在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，exosome介導(dǎo)了關(guān)鍵的步驟，如刺激血管生成，削弱免疫反應(yīng)，甚至參與了轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。在正常的生理和妊娠過(guò)程中，exosome也起了重要作用，如胎盤exosome幫助形成對(duì)母親免疫系統(tǒng)的免疫抑制屏障。總之，在正常和病理的條件下，細(xì)胞都釋放小囊泡，以各種方式影響其他細(xì)胞。

這些囊泡中的核酸成分，尤其是RNA，引起了人們的極大興趣。相對(duì)于血液中那些“無(wú)瓦遮頭”的RNA，囊泡為RNA創(chuàng)造了一個(gè)天然的穩(wěn)定環(huán)境，保護(hù)它們免受RNase的降解。通過(guò)RNA-Seq、雜交芯片及其他方法的分析，人們發(fā)現(xiàn)囊泡中存在過(guò)去未知的各種轉(zhuǎn)錄本，包括miRNA和其他種類的小分子非編碼RNA，以及mRNA、tRNA、lncRNA和rRNA。

因此，exosome及其他細(xì)胞外囊泡有望作為生物標(biāo)志物，在癌癥及其他疾病的診斷中發(fā)揮一定的作用。囊泡的脂雙層結(jié)構(gòu)使得新鮮和長(zhǎng)期保存的樣本皆可用于RNA分析，甚至一些冷凍達(dá)十二年之久的樣本也能產(chǎn)生高質(zhì)量的RNA。當(dāng)然，我們首先得分離出這些小囊泡。

超速離心是分離小囊泡的常用方法，產(chǎn)量高，質(zhì)量也OK，不過(guò)首先你得有一臺(tái)超速離心機(jī)。而且，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)耗力，還需要精心優(yōu)化操作。目前沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的操作可循，實(shí)驗(yàn)室使用不同的前處理以及不同的超速離心操作。這就使得各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果幾乎沒(méi)辦法比較。后來(lái)，人們又開(kāi)發(fā)出多種替代方法，如抗體捕獲、聚合物沉淀等，有一定的作用，但也存在一些缺點(diǎn)。

為此，Exosome Diagnostics公司開(kāi)發(fā)出一種基于離心柱的簡(jiǎn)便方法來(lái)分離EV，并提取出其中的RNA。上個(gè)月，研究人員在《PLoS ONE》上介紹了這種新方法。與超速離心相比，這種方法能分離出高純度的RNA，并且對(duì)囊泡RNA有著高的特異性。離心柱能夠容納4 mL樣本，實(shí)現(xiàn)了血清和血漿中低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)。目前，基于此技術(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品 – exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit – 已由QIAGEN推出。文章以此為例進(jìn)行了詳細(xì)介紹。

離心柱，更方便

這種方法使用了膜親和結(jié)合步驟來(lái)分離exosome及其他EV。它無(wú)法通過(guò)大小或細(xì)胞來(lái)源對(duì)EV進(jìn)行區(qū)分，也不依賴于是否存在微粒表位。它運(yùn)用了囊泡的通用生化特性來(lái)提取樣本中的所有細(xì)胞外囊泡。因此，在開(kāi)始提取前需要對(duì)樣品進(jìn)行離心或過(guò)濾操作，以便完全去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片、凋亡小體等組分。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，從血清/血漿樣本到RNA產(chǎn)物，只需1小時(shí)。實(shí)驗(yàn)包括兩步：純化exosome和分離RNA。在exosome純化步驟，預(yù)過(guò)濾的血漿與結(jié)合緩沖液（XBP）混合后，加至exoEasy親和性膜離心柱上，讓囊泡與膜結(jié)合。離心之后，使用洗滌緩沖液（XWP）洗滌結(jié)合在膜上的囊泡，之后利用QIAzol裂解。在RNA分離步驟，QIAzol洗脫液中加入氯仿，回收水相，將其與乙醇混合。總RNA結(jié)合到離心柱上，洗滌三次后洗脫。

研究人員發(fā)現(xiàn)，與超速離心法相比，新的方法不僅速度更快，而且產(chǎn)物純度更高。掃描電鏡顯示，雖然這兩種純化技術(shù)都能夠純化預(yù)期大小（50-200 nm）的完整的囊泡，但超速離心的產(chǎn)物還含有很多不符合預(yù)期、更小或其他形狀的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖1）。

 
圖1：分離后囊泡的掃描電鏡分析。左：超速離心法；右：exoEasy的洗脫物（圖片來(lái)自PLoS ONE）

既然exosome及其他細(xì)胞囊泡有望用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和診斷的開(kāi)發(fā)，那么RNA制備的質(zhì)量和重復(fù)性可是相當(dāng)重要的。為此，研究人員也使用Bioanalyzer對(duì)這兩種方法分離的囊泡RNA大小進(jìn)行分析。他們對(duì)血漿進(jìn)行預(yù)過(guò)濾（0.8 µm），去除較大的微粒，之后通過(guò)目前常用的超速離心法，或exoRNeasy方法分離囊泡。分析表明，兩種方法純化所得的RNA在大小和產(chǎn)量上相似。

 
圖2：癌癥患者血漿的總RNA大小分布圖。（圖片來(lái)自PLoS ONE）

至于離心柱分離了哪些種類的RNA，研究人員也進(jìn)行了深究。他們使用最小的起始樣品量0.2 mL，利用RT-qPCR對(duì)exoRNeasy純化的RNA產(chǎn)物和exoEasy分離柱的流出液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，exoRNeasy的產(chǎn)物包括血漿中所有mRNA，以及特定的miRNA，如let-7a和miR-142-3p（圖3）。同時(shí)，一些無(wú)細(xì)胞的循環(huán)miRNA和與Ago2蛋白結(jié)合的miRNA則保留在流出液中。

 
圖3：血漿中mRNA和miRNA的回收。（圖片來(lái)自PLoS ONE）

這種離心柱的方法不僅簡(jiǎn)便，也能夠擴(kuò)展。當(dāng)樣本體積有限，或感興趣的轉(zhuǎn)錄本以高拷貝數(shù)存在時(shí)，你可以使用200 μL或更少的體積；而對(duì)于稀有轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)，或下游分析是芯片或測(cè)序時(shí)，你也可以使用4 mL或更多的體積。你看，就是這么任性。

研究人員認(rèn)為，這種基于離心柱的新方法與現(xiàn)有的產(chǎn)品和操作相比，展現(xiàn)出相當(dāng)或更好的RNA產(chǎn)量和純度，同時(shí)可適應(yīng)大范圍的樣品量，實(shí)現(xiàn)低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)。它特異性分離EV中包含的RNA，而排除蛋白相關(guān)的循環(huán)RNA，帶來(lái)了一個(gè)方便快捷的流程，適合常規(guī)使用。

囊泡，快到碗里來(lái)

也許，你更感興趣的是囊泡本身，而不是其中的RNA。那么，你可以試試QIAGEN新的exoEasy Maxi Kit。它可從血漿、血清及細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化exosome及其他EV。

exoEasy Maxi Kit的原理同上，使用離心柱及專門的緩沖液來(lái)從預(yù)過(guò)濾的生物液體中純化exosome；可處理高達(dá)4 mL的血漿或血清。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可從高達(dá)32 mL的樣品中成功提取exosome。不過(guò)，上清中的囊泡濃度依賴于細(xì)胞類型及培養(yǎng)條件；因此QIAGEN建議上清體積不要超過(guò)16 mL。更高的樣品體積可能導(dǎo)致囊泡的回收率降低。

整個(gè)流程僅僅需要25分鐘。將預(yù)先過(guò)濾過(guò)的血漿、血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清與Buffer XBP進(jìn)行混合并結(jié)合在exoEasy膜親和離心柱上。對(duì)結(jié)合的exosome使用Buffer XWP進(jìn)行清洗，隨后使用Buffer XE（主要含無(wú)機(jī)鹽的緩沖液）進(jìn)行洗脫，即可用于物理或生化分析。不過(guò)，對(duì)于生物檢測(cè)等特定應(yīng)用，可能需要進(jìn)行額外的濃縮或緩沖液置換。此步驟可通過(guò)孔徑尺寸為100 kDa或更小的超濾方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。

提取獲得的囊泡具有完整的功能，可用于多種下游應(yīng)用。比如通過(guò)納米顆粒追蹤分析（NTA）或可調(diào)電阻脈沖感應(yīng)（TRPS）對(duì)其物理性質(zhì)進(jìn)行分析，或者利用電子顯微鏡分析。當(dāng)然，你也可以提取出其中的DNA、RNA、蛋白或脂類，開(kāi)展進(jìn)一步的分析。

現(xiàn)在，你是不是對(duì)exosome分析如釋重負(fù)了呢。沒(méi)有超速離心機(jī)，只有普通離心機(jī)，我們一樣能獲得高純度的exosome。

目前，QIAGEN提供了四種exsome研究相關(guān)試劑盒。 exoRNeasy Maxi kit用于exosome分離；其他三種純化囊泡RNA的試劑盒，Maxi最多可處理4 mL的血清/血漿；Midi的處理量不大于1 mL。如果你需要處理不同起始量的樣品，Starter Kit則最合適。

索取QIAGEN exosome相關(guān)產(chǎn)品的詳細(xì)資料

（生物通 余亮）

參考文獻(xiàn)：

Enderle D, Spiel A, Coticchia CM, Berghoff E, Mueller R, Schlumpberger M, et al. (2015)
Characterization of RNA from Exosomes and Other Extracellular Vesicles Isolated by a Novel Spin Column-Based Method. PLoS ONE 10(8): e0136133. doi:10.1371/journal.pone.0136133