說起SNP Genotyping，大家熟悉的產品很多。例如*經典的Taqman熒光探針法，至今也是Genotyping的金標準。還有Sequenome Massarray飛行時間質譜法，在醫學方向應用很多，也有很多商品化檢測試劑盒，不過Sequenome需要引物組合做多重PCR，摸索優化難度比較大，耗材成本也不低。前幾年大家經常提起的，高分辨熔融曲線HRM也算一個吧，HRM以高靈敏，低成本，靈活的優勢深受不少科研工作者的喜愛，只是這項技術對于引物設計和實驗操作，儀器的靈敏度和重復性要求都比較高，HRM都是針對一段DNA片段而不是一個位點進行熔融溫度差異分析，片段的長短，堿基差異，堿基構成都是影響因素，重復性并不好，HRM更適合于尋找突變體，而非SNP檢測，所以大部分客戶體驗并不好。

那么今天要分享的基因有限公司代理產品，英國LGC公司的KASP技術，原理上類似Taqman檢測，也是基于終端熒光讀取判斷，每孔采用雙色熒光檢測一個樣本的一個位點可能的兩種基因型，不同的SNP模板對應不同的熒光產物。所以這項技術的準確度與金標準Taqman一致，而KASP技術與Taqman技術不同的是，它不需要每個SNP位點都去合成特異的熒光引物，它基于自己獨特的ARM PCR原理，讓所有的位點檢測*終都使用通用熒光引物擴增，這大大降低了LGC KASP的試劑成本，既有金標準的準確，又降低了使用成本，比Taqman還具有更好的位點適應性，所以在醫學、農學檢測方面LGC KASP都有非常好的應用，并在一系列高水平的文章中都有體現，后續我們會繼續介紹。

從具體技術上比較，Taqman探針，一般采取8-12個bp的長度，圍繞SNP位點兩端進行設計，但對于整個基因組，如此短的探針，可能導致存在多個同源序列進行擴增，造成背景增高，目標位點的完全匹配雜交信號降低，相對而言，KASP的特異性引物通常采用24-26bp，會有更高的特異性，SNP call rate會更高。

另一種情況，可能存在相鄰只有幾個bp的SNP位點，Taqman探針設計的轉化就很困難，因為Taqman的SNP位點必須設計在探針的中間，有可能雜交信號很弱，同樣，如果目標位點存在單堿基多次重復序列，Taqman探針方法轉化也也很困難，對于這兩類位點，KASP方法，因為是末端識別目標位點，可以很好的解決此事。

除了檢測SNP位點以外，因為引物片段達到24-26bp，KASP還可以適用于檢測較大片段的插入Indels。

還有一個優勢，就和錢包有關了，關鍵問題一，質保期，因為KASP是分成非標記的引物和熒光標記的Master Mixer兩部分保存，前者是非熒光標記，質保期長，后者是長期通用性消耗品，客戶根據自己消耗量進行采購，浪費少，而Taqman探針是熒光標記的，每一份都是針對特定位點設計合成的，如果有效期內不能充分使用，就會浪費。

別只算紙面成本，那都是假設使用充分為前提的，還是設想一下實際應用場景吧，打開超低溫冰箱看一下，前任們留下了多少熒光探針呀，那都是老板的錢呀。

關鍵問題二，對于新位點的摸索優化條件，只需要設計引物就行了，就和您做一個新的PCR實驗相當，KASP技術與客戶本身的PCR體系更為接近，其優化也更簡單，更有效率。無需訂制Taqman探針，甚至購買昂貴的Massarray耗材，據說有個大牛規定，嚴禁學生私自使用Sequenom 進行新位點摸索，防止掉進坑里。

KASP技術，就是基因分型研究者指尖跳躍的珠鏈，隨性，靈動。

在SNP的系統性研究中，我們一般首先使用NGS測序，構建研究物種或性狀的SNP數據庫，或者直接調用公共數據庫，然后使用芯片或者其他中等密度SNP研究平臺在實驗組和對照組中進行SNP的篩選，也就是所謂的"GWAS“全基因組關聯分析，當候選SNP的數量降到幾十個或更少時，也就是低SNP密度高樣本通量時，KASP就是*合適的技術了，可以用于replication實驗組，進行大樣本量的分型。

KASP技術具有靈活、便宜、準確的特點，采用KASP技術進行SNP檢測的文獻連篇累牘，目前已經超過2000篇，其中的著名刊物比比皆是，略舉一二。

2014年1月Nature Genetics發表題為“A genome-wideassociation study identifies multiple susceptibility loci for chroniclymphocytic leukemia”的文章，這篇關于慢性淋巴細胞白血病的研究先是使用全基因組高密度SNP芯片進行GWAS分析，得到若干候選SNP，為了判斷這些候選SNP是否與表型相關，又設計replication組進行驗證，合計2組，分別是803/2780（case/control）和341/371，全文在4295個人中分析GWAS分析中得到的7個候選SNP，反應量超過3萬，用的就是LGC KASP技術。

2013年11月Blood發表題為“Variation at 10p12.2 and 10p14influences risk of childhood B-cell acutelymphoblastic leukemia and phenotype”的文章，英國癌癥研究所基于German GWAS研究已經證實7p12.2，9p21.3，10q21.2，14q11.2與BCP-ALL相關。在此基礎上他們吸收了前人發表的同類GWAS數據進行Meta分析，聯合分析后找出8個位點進入replication驗證，使用的就是KASPar平臺，*后找出2個相關位點，rs10828317和rs3824662，分別影響了PIP4K2A和GATA3基因，都與ALL顯著相關。而且后者可以作為生存率的判斷指標。

2013年6月Science發表題為“Identification of Wheat GeneSr35 ThatConfers Resistance to Ug99 Stem Rust Race Group”的文章，鑒定了小麥的抗桿銹病基因CL9，是典型的對QTL進行精細掃描來鑒定功能基因的思路。Sr35是之前在一粒小麥（Triticummonococcum）中確定的含抗桿銹病基因的QTL，該QTL在3Am染色體的長臂，長度大約是2.2-3.1cM（1cM大約是100萬對堿基的長度）。該QTL有很多基因，Science該文就是對該QTL進行精細掃描，來尋找具體的抗桿銹病基因。首先，在該QTL內，進行7個分子標記（ssr等）的掃描，把候選基因鎖定在2個分子標記之間，該區域長度大概為0.97cM；接著，在一粒小麥的抗病品系DV92的BAC文庫中篩選出含此QTL的BAC克隆，對含此QTL的3個BAC克隆進行NGS測序，長度為307,519bp，并對其中的多個基因進行生物信息學分析。對該區域進行進一步分子標記（SSR等）分析，發現其中213kb區域內的4個基因（APGG1,CNL4, CNL6， CNL9）是抗桿銹病候選基因。進一步，對不同的一粒小麥的這4個基因進行一代測序，鑒定出2個抗性單倍型和6個易感單倍型；被測序的小麥包括24種抗桿銹病的和25種桿銹病易感的。所有易感的一粒小麥的CL9基因都具有突變，其中3個SNP導致編碼氨基酸的序列改變。其中測序發現的SNP的后續分析就是采用KASP技術（8微升體系，在StepOnePlus™ Real-Time PCR System (AppliedBiosystems)運行檢測,KASP技術的另一個突出特點就是儀器系統的開放性，使用實驗室本身的定量PCR進行檢測，事先進行測試設定就可以了）。

隨著KASP的技術不斷成熟，越來越多的實驗室選擇相應的LGC SNPLine儀器平臺，建立自己的高通量SNP分析平臺，基因有限公司也已經引進全套儀器平臺，開始高通量SNP技術服務工作，對于研究SNP的科學家而言，又多了一種選擇。

對于LGC公司，KASP技術，SNP技術服務，有任何問題，請咨詢您身邊的基因有限公司人員。