生物通報道：CRISPR/Cas9系統，為定向誘變和靶向基因組修飾提供了多種可能性。基因工程CRISPR-Cas核酸酶是由一種叫做Cas9的DNA切割酶，和一段與靶DNA片段匹配的20個核苷酸長度的短RNA片段所構成。它模擬了某些細菌的原始免疫系統。當這些微生物受到病毒或其他生物體的感染時，它們會拷貝入侵者的一段遺傳密碼，將它插入到自身的DNA中，并傳遞給細菌后代。如果在未來遇到相同的病原體，細菌的Cas9在與拷貝DNA片段匹配的RNA序列的引導下，通過在靶位點切割病原體的DNA而滅活它。

由于20個核苷酸長度的序列可以多次出現在一個給定的基因組中，CRISPR/Cas9復合體可能就會接受一些錯配，因此，對靶位點進行高效而可靠的電腦模擬選擇和評估，是實驗成功的一個關鍵前提。為此，德國海德堡大學的科學家提出了一種CRISPR/Cas9打靶在線預測工具（CCTop, http://crispr.cos.uni-heidelberg.de），以克服現有工具所存在的局限性。相關研究結果發表在四月二十四日的國際著名學術期刊《PLOS ONE》。延伸閱讀：劉小樂等：分析CRISPR/Cas9敲除的新算法。

隨著工程核酸酶（如轉錄激活因子樣效應器核酸酶TALEN）、鋅指核酸酶（ZEN）或促進任何選擇位點雙鏈斷裂（DSB）引入的RNA引導性核酸酶的出現，靶向基因組編輯技術已經可用于全部（模型）生物研究。

規律成簇間隔短回文重復（CRISPR）/ CRISPR相關9（Cas9）系統，最初被發現是古細菌和細菌的“免疫反應”，已經迅速演變為一種選擇工具。單導向RNA（sgRNA）可提供特異性并靶定Cas9內切酶，以將DSB引入sgRNA所確定的位點。靶序列的特點是：長二十個核苷酸，接著是一段原型間隔（protospacer）毗鄰基序（PAM；在Cas9中是NRG）。有了這些簡單的設計標準，我們就可以靶定一個特定基因組中的任何位點。然而，由于20個核苷酸長度的序列可以多次出現在一個給定的基因組中，CRISPR/Cas9復合體可能就會接受一些錯配，因此，對靶向位點進行高效而可靠的電腦模擬選擇和評估，是實驗成功的一個關鍵前提。

為此，已經有許多在線查找和評價sgRNA打靶的工具，如CRISPR Design、E-CRISP或CHOPCHOP。對于打靶位點的選擇，它們都有各自的長處和局限。特別是一些工具運行于限制性的參數集，在脫靶搜尋時考慮的不匹配太少，完全缺乏關于潛在脫靶位點的文檔，或者只有一個有限的靶基因組列表。

為了給生物學家提供一種工具，以快速和有效地識別高質量的靶位點，該研究小組在新開發的CRISPR/Cas9打靶在線預測工具（CCTop）中結合優勢并克服局限性。CCTop提供了一種直觀的用戶界面，有合理默認的參數，可以很容易地由用戶調整。根據一段給定的輸入序列，CCTop可以根據候選sgRNA靶位點的脫靶質量，識別并排列所有的候選sgRNA靶位點，并顯示完整的文檔。CCTop已經通過實驗驗證用于基因滅活、非同源末端連接以及同源指導修復。因此，CCTop為生物學家們提供了一種工具，可快速而有效地識別高質量的靶位點。

（生物通：王英）

生物通推薦原文摘要：
CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool
Abstract: Engineering of the CRISPR/Cas9 system has opened a plethora of new opportunities for site-directed mutagenesis and targeted genome modification. Fundamental to this is a stretch of twenty nucleotides at the 5’ end of a guide RNA that provides specificity to the bound Cas9 endonuclease. Since a sequence of twenty nucleotides can occur multiple times in a given genome and some mismatches seem to be accepted by the CRISPR/Cas9 complex, an efficient and reliable in silico selection and evaluation of the targeting site is key prerequisite for the experimental success. Here we present the CRISPR/Cas9 target online predictor (CCTop, http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) to overcome limitations of already available tools. CCTop provides an intuitive user interface with reasonable default parameters that can easily be tuned by the user. From a given query sequence, CCTop identifies and ranks all candidate sgRNA target sites according to their off-target quality and displays full documentation. CCTop was experimentally validated for gene inactivation, non-homologous end-joining as well as homology directed repair. Thus, CCTop provides the bench biologist with a tool for the rapid and efficient identification of high quality target sites.