生物通報(bào)道  所有的分子生物學(xué)家都會(huì)告訴你：將DNA片段克隆到載體中去是一件棘手的事情。研究人員要查看復(fù)雜的限制性酶切圖譜，費(fèi)盡心力找到適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶組合，然后熬過(guò)漫長(zhǎng)的連接和轉(zhuǎn)化過(guò)程，希望能夠生成少數(shù)正確插入的克隆。那如果能夠擺脫所有這些繁瑣的步驟，在任意位點(diǎn)切割質(zhì)粒，然后無(wú)縫插入你的靶DNA，會(huì)怎么樣呢？

南佛羅里達(dá)大學(xué)Morsani醫(yī)學(xué)院變態(tài)反應(yīng)和免疫學(xué)部助理教授王佳望（Jia-Wang Wang，音譯）博士說(shuō)：“我們過(guò)去一直在構(gòu)建一個(gè)大尺寸的基因敲入靶載體，最終的步驟是將一個(gè)青色熒光蛋白( cyan fluorescent protein , CFP)插入到載體中。由于插入位點(diǎn)沒(méi)有獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)，我們幾次嘗試一種連接四個(gè)片段的策略，沒(méi)有取得成功�！�

這一克隆困境使得王佳望和研究小組重新思考他們的策略，最終他們轉(zhuǎn)向了另一種基因組工程系統(tǒng)——CRISPR/Cas9。他們?cè)诮�期發(fā)表在《生物技術(shù)》（BioTechniques）雜志上的新研究論文中詳細(xì)描述了這種體外“CRISPR克隆”法。

王佳望說(shuō)：“我們認(rèn)為，既然CRISPR/Cas9已被成功應(yīng)用于編輯許多物種的基因組，應(yīng)該也可以用作為一種特殊的‘限制性?xún)?nèi)切酶’來(lái)特異地切割DNA進(jìn)行體外克隆。”

王佳望的克隆方法很簡(jiǎn)單：他利用了Cas9酶精細(xì)的特異性和體內(nèi)切割能力，將DNA片段克隆到了體外的“挑戰(zhàn)性”載體中。以往的體內(nèi)研究證實(shí)，結(jié)合單導(dǎo)向RNA (single-guide RNA,sgRNA), Cas9能夠以遠(yuǎn)超限制性?xún)?nèi)切酶的特異性定點(diǎn)切割DNA。王佳望意識(shí)到，如果能夠在體外實(shí)現(xiàn)這樣的特異性切割，再結(jié)合一種DNA連接方法，就可以構(gòu)建出一種強(qiáng)大的、改造和克隆DNA片段的新工具。

為了確定他們的方法的可行性，作者們采用一個(gè)22-kb的質(zhì)粒和針對(duì)T3啟動(dòng)子的一條sgRNA進(jìn)行了測(cè)試。他們?cè)O(shè)計(jì)了多個(gè)長(zhǎng)度不同的sgRNA版本來(lái)評(píng)估脫靶效應(yīng)及切割效率（延伸閱讀：華裔牛人Nature子刊將CRISPR-Cas9特異性提高25倍）。數(shù)據(jù)顯示，Cas9與一個(gè)19-bp的sgRNA一起能夠?qū)崿F(xiàn)有效切割，且沒(méi)有脫靶效應(yīng)，證實(shí)了這一系統(tǒng)可用于特異的位點(diǎn)切割大型DNA載體實(shí)現(xiàn)克隆應(yīng)用。為了進(jìn)一步加快和簡(jiǎn)化克隆過(guò)程，作者們隨后利用了2009年開(kāi)發(fā)的Gibson assembly方法，將一個(gè)DNA片段無(wú)縫插入到了CRISPR/Cas9線(xiàn)性化的22-kb大小的質(zhì)粒中。

王佳望指出，盡管這一技術(shù)非常強(qiáng)大，能夠有效地應(yīng)用于大量的載體，那些有興趣在自己的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用這一技術(shù)的研究人員在制備過(guò)程中仍然要謹(jǐn)慎剪切這樣的大型載體，利用高質(zhì)量的Cas9酶來(lái)獲得最佳的結(jié)果。

雖然，較為常規(guī)的克隆應(yīng)用可能不需要這種新的“CRISPR克隆”方法，但是顯然有些時(shí)候你實(shí)驗(yàn)室的工具箱中有這樣的一項(xiàng)技術(shù)會(huì)特別的有用。王佳望和合著者指出，當(dāng)采用諸如細(xì)菌人工染色體或腺病毒載體一類(lèi)的大型載體開(kāi)展研究，無(wú)法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，想找到獨(dú)特的酶切位點(diǎn)面對(duì)著挑戰(zhàn)之時(shí)，以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的克隆技術(shù)將為急需的DNA克隆提供一條更快、更有效的途經(jīng)。

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文索引：

Wang, J-W., Wang, A., Li K., Wang, B., et al. 2015. CRISPR/Cas9 nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning. BioTechniques 58:161-170. doi 10.2144/000114261.