過去6年，生物通一直在追蹤生命科學(xué)領(lǐng)域最前沿的創(chuàng)新產(chǎn)品，將其介紹給大家。2014年，生物通繼續(xù)搜羅新上市的產(chǎn)品，為大家奉上一場技術(shù)盛宴。經(jīng)過一個半月的網(wǎng)頁和微信投票以及專家評鑒，2014生命科學(xué)十大創(chuàng)新產(chǎn)品終于出爐。

Pacific Biosciences公司的測序儀雖說之前也上過榜，但這一次，它再度升級了測序聚合酶和化學(xué)染料（P6-C4），讓PacBio測序儀的平均讀取長度提高到10,000 bp或者更長，有>50%的序列長度都超過了14,000 bp，最長讀長甚至超過40,000 bp。這不僅僅是數(shù)字上的增加，也帶來了二代測序無法實現(xiàn)的應(yīng)用。2014年，PacBio技術(shù)發(fā)表在多個重要期刊上，而儀器銷量也節(jié)節(jié)攀升，這體現(xiàn)了它的價值正為更多人所認(rèn)可。

如此看來，PacBio測序儀被評為2014生命科學(xué)創(chuàng)新產(chǎn)品，也是理所當(dāng)然的。為了讓大家更好地了解這一產(chǎn)品，生物通采訪了PacBio中國地區(qū)代理商 – 基因有限公司的技術(shù)專家。

Q：PacBio今年的升級主要體現(xiàn)在哪些性能的改善？這具有什么意義？

A：2014年10月下旬，目前市面上唯一的第三代測序設(shè)備供應(yīng)商Pacific Biosciences再度升級了測序聚合酶和化學(xué)染料試劑（P6-C4），進一步增加了其原本就傲視群雄的序列讀取長度，N50超過了14 kb，這無疑是測序?qū)帽�發(fā)的又一枚超級炸彈。

P6-C4試劑可以將PacBio的平均讀取長度提高到10,000 bp或者更長，有>50%的序列長度都超過了14,000bp，最長讀長> 40,000bp，在業(yè)界遙遙領(lǐng)先。并且，通量上也有了進一步的提高，升級后每個SMRT Cell的有效數(shù)據(jù)產(chǎn)出量高達500 Mb-1 Gb。這種性能的提高，其中一部分原因是PacBio在原有C3試劑的光保護染料（photo-protected dyes of the C3 chemistry）基礎(chǔ)上進行了升級，新的化學(xué)試劑同時結(jié)合了C2的精確度與C3的讀取長度兩種優(yōu)點。PacBio建議用戶采用新的化學(xué)試劑來實現(xiàn)所有基于PacBio測序儀的相關(guān)應(yīng)用。

本次升級同時發(fā)布的還有新的軟件SMRT® Analysis v2.3。軟件包括改進的長擴增子分析，Iso-Seq™應(yīng)用，Quiver以及CCS，同時還有性能的提升。這些更新進一步增強了結(jié)果的準(zhǔn)確度，加快了分析速度，并且為混合的各種大小的擴增子分析如全長HLA Class I 和Class II 基因提供了更多的選擇。

關(guān)于P6-C4試劑的具體表現(xiàn)，美國最好的植物科學(xué)研究中心---密蘇里州Danforth植物科學(xué)中心的Robert Van Buren于2015年1月10日-14日在美國圣地亞哥舉辦的第23屆國際動植物基因組大會上做了介紹。他采用PacBio P6-C4試劑對基因組非常復(fù)雜的黍草進行De novo Assembly，做了65×的測序深度，用了23個SMRT Cells，得到了18 Gb的數(shù)據(jù)，平均讀長為12.872 kb，N50為16.485 kb，該植物的端粒區(qū)含有長度為5-10 kb的TTTAGGG重復(fù)，PacBio幫助他們成功地跨越了該區(qū)域。

除了長讀長在動植物領(lǐng)域帶來的重大改善，越來越多的基因組測序中心也開始關(guān)注于人類的疾病基因組測序，需要產(chǎn)生"Medical Grade Information“，也就是醫(yī)學(xué)級數(shù)據(jù)，二代測序受制于其技術(shù)原理，很多情況下，無法得到準(zhǔn)確的定位和定量序列信息，信息并不完整，垃圾數(shù)據(jù)含量過大，一些基因的結(jié)構(gòu)異常，如多達幾百bp甚至更長的重復(fù)序列tandem repeat，大片段的易位translocation，二代測序都無法發(fā)現(xiàn)，這些都是無法通過加深測序深度及生物信息學(xué)分析進行彌補的。而測序讀長長，就可以解決在二代測序視野中無法解決的此類問題。

More Than Longer，豈止于長。

Q：PacBio今年發(fā)表了不少好文章，是否能挑選有代表性的文章給大家介紹一下？

A：不得不提的一篇文章來發(fā)表在2014年11月10日的《自然》（Nature）雜志上。該文利用PacBio單分子實時測序測序技術(shù)，揭示出了人類基因組中成千上萬從未見過的遺傳變異。這些研究發(fā)現(xiàn)關(guān)閉了長期以來因無法測序造成的許多人類基因組作圖缺口，這一發(fā)現(xiàn)被業(yè)界評論為首次構(gòu)建了白金人類基因組！

領(lǐng)導(dǎo)這一研究小組的是華盛頓大學(xué)基因組學(xué)系教授、霍華德•休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員、弗雷德•哈欽森癌癥研究中心人類生物學(xué)部兼職教授Evan Eichler博士，其主要從事于基因組學(xué)與生物信息學(xué)研究，是國際上進行人和其他靈長類動物比較功能基因組學(xué)與生物信息學(xué)研究的頂尖科學(xué)家。在Cell、Nature、Science等國際頂尖學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表了具有重要影響力的論文260多篇。

了解PacBio單分子測序儀的更多應(yīng)用

Eichler說：“長期以來科學(xué)家們對許多疾病的遺傳病因都感到困惑不解。這一稱作為單分子、實時DNA測序(SMRT)的新技術(shù)，使得研究人員現(xiàn)在鑒別出這些疾病背后的潛在遺傳突變成為了可能。現(xiàn)在，我們進入到了以往對我們來說不透明的一個遺傳變異的全新領(lǐng)域。”到目前為止，科學(xué)家們還只能確定大約一半遺傳性疾病的遺傳病因。盡管無數(shù)科研人員在經(jīng)年累月地進行研究，但人們還是未能找到許多人類疾病和特征背后的遺傳因素，例如身高等家族特征和二型糖尿病患病風(fēng)險。這一謎題被稱為“遺傳性缺失”（missing heritability）。導(dǎo)致這一問題的一個原因在于，標(biāo)準(zhǔn)的基因組測序技術(shù)無法精確繪制基因組許多組成區(qū)域的圖譜。這些方法是通過排列通常大約為100個堿基長度的、億萬的重疊的DNA小片段，隨后分析它們的DNA序列來構(gòu)建基因組圖譜。這種方法已成功繪出了數(shù)百萬人類基因組中的小變異。這些由單核苷酸堿基替換引起的變異，稱作為單核苷酸多態(tài)（SNP）。但由于一些技術(shù)原因，以往科學(xué)家們無法可靠地檢測出長度在大約50-5000個堿基之間的變異。

新研究中所采用的這一SMRT技術(shù)使得測序和讀取長度超過5000個堿基的DNA片段成為可能，比標(biāo)準(zhǔn)的基因測序技術(shù)還要長。這一由Pacific Biosciences開發(fā)的“長讀長”技術(shù)，使得研究人員能夠構(gòu)建出相比以往更高分辨率的基因組結(jié)構(gòu)變異圖譜。研究的主要作者、Eichler實驗室博士后Mark Chaisson開發(fā)出了這種方法，使得利用這一數(shù)據(jù)以堿基對分辨率來檢測結(jié)構(gòu)變異成為了可能。為了簡化他們的分析，研究人員利用了來自葡萄胎（hydatidiform mole）的基因組。葡萄胎是由精子與缺乏母源DNA的卵子受精所導(dǎo)致的一種異常生長物。葡萄胎的基因組織只包含每個基因的一個拷貝，而非存在于正常細(xì)胞中的兩個拷貝，簡化了搜尋遺傳變異。在葡萄胎中應(yīng)用這一新方法，研究人員鑒別并測序了與基因組研究中標(biāo)準(zhǔn)人類參考基因組不同的26,079個片段。

Eichler說，其中大多數(shù)的變異（大約22,000個）從未被報道。“這些研究結(jié)果表明，我們錯失了很多的變異。”這一技術(shù)還使得Eichler和同事們繪制出了160個基因組片段的圖譜，在過去一直難以對這些稱作為常染色體缺口（euchromatic gaps）的片段進行測序。他們的努力關(guān)閉了50個這樣的缺口，縮小了其他40個缺口。這些缺口包括一些重要的序列，一些基因的組成序列以及幫助控制基因表達的一些調(diào)控元件。在這些缺口中的一些DNA片段顯示出已知對大腸桿菌有毒的標(biāo)記。大腸桿菌是常用于一些基因組測序過程的一種細(xì)菌。如果將這樣的DNA序列置于大腸桿菌中，有可能細(xì)菌會刪除這一DNA。”這或許可以解釋為什么不能采用標(biāo)準(zhǔn)方法來對其進行測序。他補充說：“這些缺口還攜帶了采用標(biāo)準(zhǔn)的測序方法無法很好復(fù)制的復(fù)雜序列。這些序列在人與人之間存在著廣泛的差異，它們有可能是一些遺傳不穩(wěn)定性熱區(qū)。”

Eichler預(yù)測：“在五年內(nèi)，會有一種長讀長測序技術(shù)將使得臨床實驗室能夠從一端到另一端測序患者的染色體。‘是的，你具有大約3百萬-4百萬的SNPs以及插入缺失，你還具有大約3萬-4萬個結(jié)構(gòu)變異。在其中，有一些結(jié)構(gòu)性變異和少數(shù)的SNPs是你易患某種疾病的原因。’知道所有這些突變將改變游戲的規(guī)則。”

Q：PacBio在2015年預(yù)計還會有哪些改進？

A：2015年，PacBio公司計劃將其測序通量提高4倍，進一步提高測序reads長度，增加樣品制備操作手冊及多個數(shù)據(jù)分析的應(yīng)用程序。總結(jié)起來就是更高（通量）、更長（讀長）、更快（分析）。而這一切的升級均來自于試劑耗材，用戶無需更換現(xiàn)有儀器。

近日，該公司首席科學(xué)官Jonas Korlach在官網(wǎng)上發(fā)表博客表示，PacBio公司計劃提高PacBio RS II測序平臺的通量，使每SMRT cell一次運行可輸出超過4 Gb數(shù)據(jù)，平均讀取長度增加到15-20 kb。去年秋天該公司升級了測序聚合酶和化學(xué)染料(P6-C4)，使每個SMRT Cell 數(shù)據(jù)輸出量從0.5G提升到1GB，平均讀長達到10-15KB。最初的PacBio RS II平臺，一天運行16個SMRT Cell只能產(chǎn)生6.4G的原始數(shù)據(jù)。PacBio公司計劃通過提升化學(xué)試劑，操作流程及軟件來提高測序質(zhì)量。包括將單一聚合酶加載到芯片上，從而提高裝載效率。

此外，該公司計劃提升樣本制備流程并將其簡單化，為混合樣本添加條形碼，發(fā)布長插入片段和全長cDNA文庫的操作手冊。在數(shù)據(jù)分析方面，PacBio公司計劃與生物信息學(xué)團隊合作開發(fā)更快的de novo組裝基因組的算法，進一步開發(fā)Falcon assembler及其他軟件來解決二倍體或多倍體基因組的分析工作，簡化全長轉(zhuǎn)錄本測序、Iso-Seq™全長轉(zhuǎn)錄本/異構(gòu)體測序以及人類白細(xì)胞抗原（HLA）單體型定相的工作流程。