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挑戰極限：皮克級鏈特異性RNA-Seq完整解決方案
【字體： 大 中 小 】 時間：2015年12月14日 來源：Takara
編輯推薦：
Clontech一直是微量樣品解決方案先驅，最新的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian采用全新的Zap R R-Probes核糖體cDNA去除技術，在合成全長cDNA文庫后去除rRNA來源的cDNA，可以250pg-10ng任意品質哺乳動物總RNA起始，5小時內即可構建Illumina®-ready cDNA文庫。
• 皮克級樣品起始—可以250pg-10 ng人，小鼠或大鼠總RNA起始
• 多能—可以多種組織樣品（包括FFPE和LCM樣品）和任意品質RNA制備文庫，獲得高重復再現數據
• 保留鏈來源信息—轉錄本鏈來源信息識別準確度高
• 快速，一體化流程—整體流程只需~5 h
• 無縫銜接Illumina測序—最多可制備96個多重標簽Illumina®-ready文庫
5h內即可制備Illumina®-ready鏈特異性測序文庫：
完美結合隨機引物起始法，SMART技術&LNA技術及全新的核糖體cDNA去除技術，可以制備包含編碼和非編碼RNA信息的高代表性文庫。
表現出色：
可以在皮克級樣品起始的情況下，獲得高靈敏度、高重復再現性結果，并且適用樣品范圍廣泛。
簡介
鏈特異性總RNA-Seq是RNA-Seq中的重要應用，通過鏈特異性測序可以區分重疊基因邊界，進行全面基因注釋和定量長非編碼RNAs。傳統的總RNA-Seq文庫制備方案通常需要100 ng-1 ug較高的RNA起始量，并且在cDNA合成和文庫制備之前需要從總RNA中去除rRNA。對于挑戰性樣品，如激光顯微切割樣品RNA，很難獲得10 ng起始樣品，并且rRNA去除過程會進一步增加樣品損失，導致文庫質量下降。Clontech一直是微量樣品解決方案先驅，最新的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian采用全新的Zap R R-Probes核糖體cDNA去除技術，在合成全長cDNA文庫后去除rRNA來源的cDNA，可以250pg-10ng任意品質哺乳動物總RNA起始，5小時內即可構建Illumina®-ready cDNA文庫。
隨機引物起始，捕獲全轉錄組信息
與oligo dT引物相比，隨機引物可以獲得代表性更全面的轉錄組信息，同時更適用于降解樣品。隨機引物可以捕獲編碼和非編碼RNA，這對于基因表達、調控研究和人類疾病研究尤為重要。
SMART，LNA和核糖體RNA去除技術確保獲得高靈敏度鏈特異文庫
結合了SMART（Switching Mechanism At 5' end of RNA Template）技術和LNA（Locked Nucleic Acid）技術，提高了模板轉換反應穩定性，同時帶有方向信息的模板轉換反應保留了RNA的鏈來源信息。
不同樣品、不同起始量都表現出色
為檢測SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian在超出推薦起始范圍的表現，分別使用100pg-10 ng的小鼠腦部總RNA制備文庫，每個起始量2個技術重復。
|
100 pg- 10 ng總RNA起始測序數據 | ||||||||
|
RNA樣品 |
小鼠腦部總RNA | |||||||
|
起始量（ng） |
10 |
1 |
0.25 |
0.1 | ||||
|
文庫產量（ng/μl） |
10.5 |
14.8 |
9.93 |
8.3 |
6.91 |
7.48 |
5.76 |
7.26 |
|
讀段數（millions） |
2.6（雙端測序） | |||||||
|
轉錄本數量 FPKM>1 |
12,714 |
12,709 |
12,744 |
12,725 |
12,540 |
12,615 |
12,286 |
12,528 |
|
皮爾遜/斯皮爾曼相關系數 |
0.99/0.93 |
0.99/0.93 |
0.98/0.92 |
0.97/0.90 | ||||
|
每個生物學注釋鏈識別準確率（%） |
97.7 |
97.7 |
97.7 |
97.7 |
97.7 |
97.7 |
97.7 |
97.6 |
|
總讀段比例（%） | ||||||||
|
外顯子 |
22.6 |
22.8 |
23.4 |
23.5 |
23.3 |
23.1 |
23.1 |
22.8 |
|
內含子 |
35.6 |
35.7 |
35.3 |
36.2 |
35.9 |
35.5 |
36.1 |
35.1 |
|
基因間區 |
8.3 |
8.2 |
8.2 |
8.2 |
8.0 |
8.0 |
7.8 |
7.8 |
|
rRNA |
11.2 |
10.5 |
10.8 |
9.9 |
9.7 |
9.7 |
8.8 |
9.5 |
|
線粒體 |
8.8 |
8.7 |
8.3 |
8.5 |
8.3 |
8.4 |
7.5 |
7.9 |
|
重復率（%） |
12.8 |
12.5 |
17.3 |
17.8 |
31.3 |
28.8 |
44.2 |
40.2 |
不同RNA起始量情況下，測序指標一致。分別使用100 pg-10 ng的小鼠腦部總RNA制備RNA-Seq文庫，每個起始量2個重復。“PCR1”所有的文庫都進行5輪擴增，“PCR2”對于10 ng，1ng，250 pg和100 pg文庫分別進行10,13,15和16輪PCR擴增。
從上表可以看出不同起始量的情況下，測序數據非常相似。FPKM>1（fragments per kilobase of exon per million reads）的轉錄本數量超過12,000，并且保留了鏈來源信息。讀段中比對到核糖體cDNA的比例在~9%到12%之間，不進行核糖體cDNA去除的情況下，比對到核糖體cDNA的比例~67%（數據未展示）。以250pg和10ng RNA 起始制備的文庫具有高度一致性（散點圖，下圖）。
推薦起始量范圍內均可獲得高復再現性結果。對采用250 pg和10 ng小鼠腦部總RNA制備的文庫的FPKMs進行比較分析。FPKM數值顯示為對數標尺。只在其中一個文庫中表現的轉錄本在圖中表現為沿X軸和Y軸的散點。
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian采用的核糖體cDNA高效去除技術適用于多種組織（人腦、胚胎、骨骼肌、心臟和脾臟；大鼠腦、肝臟和腎臟；小鼠腦和肝臟）。分別采用R-Probes切割核糖體cDNA或不切割處理樣品制備文庫。在處理的情況下，比對到rRNA的讀段數量顯著降低，約占總讀段數的10-30%，不同的組織間有所不同（見下表）。同時，對轉錄本識別有用的讀段數（外顯子）得到了5-10倍的提升。
|
腦 |
胎盤 |
骨骼肌 |
心臟 |
脾臟 | ||||||
|
核糖體cDNA去除 |
（-） |
（+） |
（-） |
（+） |
（-） |
（+） |
（-） |
（+） |
（-） |
（+） |
|
文庫產量（ng/μl） |
18.1 |
5.2 |
10.2 |
3.7 |
11.5 |
2.4 |
9.9 |
3.8 |
10.6 |
3.2 |
|
轉錄本數量FPKM>1 |
12,581 |
15,693 |
9,079 |
13,095 |
6,619 |
11,879 |
7,667 |
14,448 |
9,900 |
15,798 |
|
每個生物學注釋鏈識別準確率（%） |
97.6 |
97.6 |
97.8 |
97.8 |
98.5 |
98.5 |
98.4 |
98.4 |
98.3 |
98.1 |
|
動物 |
大鼠 |
小鼠 | ||||||||
|
組織類型 |
腦 |
肝臟 |
腎臟 |
腦 |
肝臟 | |||||
|
核糖體cDNA去除 |
（-） |
（+） |
（-） |
（+） |
（-） |
（+） |
（-） |
（+） |
（-） |
（+） |
|
文庫產量（ng/μl） |
18.7 |
4.3 |
20.8 |
2.7 |
18.8 |
3.7 |
15.8 |
14.2 |
18.0 |
5.2 |
|
轉錄本數量FPKM>1 |
8,618 |
12,477 |
5,645 |
10,647 |
7,939 |
13,197 |
10,465 |
12,627 |
8,001 |
10,922 |
提升了人、嚙齒類動物組織中外顯子比對率和轉錄本識別數量。分別采用250 pg人總RNA和250 或500 pg大鼠、小鼠總RNA制備文庫，對未經R-Probes處理（-）和處理（+）文庫的各讀段分布情況進行分析。
創新的核糖體cDNA去除技術可以在有效維持基因代表性的同時，顯著提高低于10ng RNA起始的基因檢測數。分別對人腦部和心臟R-Probes處理和非處理文庫進行比較分析，我們可以看到處理和非處理文庫具有高度的一致性（散點圖）。這表明核糖體cDNA去除技術特異針對rRNA，沒有顯著的脫靶效應。
核糖體cDNA去除和非去除文庫具有高度一致性。分別采用250 pg人腦部或心臟總RNA制備文庫，對經過核糖體cDNA去除（+）和非去除（-）處理（如分別經過或非經過R-Probes處理）文庫的FPKMs進行比較分析。FPKM數值顯示為對數標尺。只在其中一個文庫中表現的轉錄本在圖中表現為沿X軸和Y軸的散點。
不同質量樣品的完整解決方案
與其他的SMARTer Stranded Kits一樣， 最新的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian整合了RNA剪切流程，可以使RNA片段化以適應Illumina測序平臺要求。同時也提供了非剪切流程用于已片段化或降解樣品。可以有效捕獲~100 nt以上的RNA片段（下圖），是微量降解樣品的理想選擇。
高效捕獲降解RNA。上圖為以250 pg高品質（RIN8）或高度降解人總RNA（RIN 2.5）分別按照SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian中4 min剪切操作流程（RIN 8）或非剪切流程（RIN 2.5）進行文庫制備后插入片段的分布情況。RNA-Seq文庫采用Illumina MiSeq® 平臺進行雙端測序。對于特定長度插入片段的比對數量與文庫中總比對片段數量進行了均一化處理。排除了比對到rRNA和線粒體基因組的片段。
綜上，SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico-Input Mammalian是針對皮克級哺乳動物總RNA挑戰性樣品，進行鏈特異性測序文庫制備的完整解決方案。SMART技術&LNA技術和核糖體rRNA去除技術，確保可以在250 pg-10 ng推薦范圍內獲得穩定、可靠的結果，同時，實驗顯示在100 pg起始的情況下也可獲得理想結果。本試劑兼容高質量、部分降解和低品質RNA，可以獲得穩定、重復再現性好的結果，并且適用樣品類型廣泛。5小時內，可以來源于多種樣品和品質的微量總RNA起始制備Illumina®-ready文庫，用于編碼和非編碼RNA分析，是新一代RNA-Seq文庫制備的重大進步。
了解更多SMART技術NGS解決方案請登錄 http://www.clontech.com/CN/Products/cDNA_Synthesis_and_Library_Construction/NGS_Learning_Resources/Selection_Guide?sitex=10022:22372:US。
