快速免疫檢測(cè)利用了抗體不能與未潤(rùn)濕的Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜的疏水表面結(jié)合，但能與膜上固定的蛋白質(zhì)結(jié)合的事實(shí)。快速免疫檢測(cè)均可與顯色底物和化學(xué)發(fā)光底物兼容。

提示：使用快速免疫檢測(cè)方法可快速觀察較高豐度的蛋白質(zhì)。若需要更高的靈敏度，請(qǐng)使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫檢測(cè)方法。

快速免疫檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是不需要封閉，節(jié)省時(shí)間，避免相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)（Mansfield，1994）。同時(shí)，因?yàn)檫^(guò)量的抗體不會(huì)與干燥的膜結(jié)合，所需的清洗次數(shù)也減少。因此，分析的總時(shí)間在2小時(shí)以下，而標(biāo)準(zhǔn)方法需要4小時(shí)以上。

切記：在開(kāi)始快速免疫檢測(cè)之前，印跡必須徹底干燥。

必需的溶液
• 一抗（目的蛋白特異的）。
• 二抗（一抗特異的），標(biāo)記堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶。
• 適合酶的底物。
• 磷酸鹽緩沖液（PBST）：10 mM 磷酸鈉、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。
• 抗體稀釋液：1%（w/v）BSA（牛血清白蛋白），0.05% 吐溫20去污劑。
• 封閉液：1%（w/v）BSA（牛血清白蛋白），0.05% 吐溫20。
• 甲醇，100%。
• Milli-Q® 水。

必需的設(shè)備
• 淺托盤(pán)，大小能容納印跡膜。
• 保鮮膜（如Saran™）、冷凍袋或紙片。
• 放射自顯影膠片和暗盒。
• 暗室和放射自顯影膠片沖洗設(shè)備。

準(zhǔn)備
1. 利用操作1.7 膜干燥方法，第44頁(yè)，讓印跡徹底變干。切勿讓甲醇再次潤(rùn)濕印跡。
2. 用稀釋液將一抗稀釋到所需的工作濃度。
3. 用稀釋液將二抗稀釋到所需的工作濃度。
注意：應(yīng)準(zhǔn)備足夠的溶液，讓每cm2 膜有0.1 mL抗體溶液（一抗和二抗）。

抗體孵育
1. 將印跡放入一抗溶液中，搖動(dòng)孵育1小時(shí)。溶液應(yīng)在膜表面自由移動(dòng)。
2. 將印跡放入PBS中，清洗5分鐘。用新鮮的緩沖液重復(fù)兩次。
3. 將印跡放入二抗溶液中，搖動(dòng)孵育30分鐘。
5. 將印跡放入PBS中，清洗5分鐘。用新鮮的緩沖液重復(fù)兩次。
6. 繼續(xù)進(jìn)行顯色、化學(xué)發(fā)光或熒光檢測(cè)，如操作3.1 標(biāo)準(zhǔn)免疫檢測(cè)方法（第48頁(yè)）所述。

利用SNAP i.d.® 2.0系統(tǒng)進(jìn)行快速的免疫檢測(cè)

SNAP i.d.® 2.0蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)是第二代的SNAP i.d.® 方法，可檢測(cè)Western印跡上具有免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。有了這種獨(dú)特的真空驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，試劑被“拉”過(guò)膜，增加了試劑與膜內(nèi)部的接觸，而不必依靠緩慢的擴(kuò)散和搖動(dòng)。這種改良的三維的試劑分布可減少免疫檢測(cè)所需的時(shí)間長(zhǎng)度。在傳統(tǒng)的Western印跡中，封閉、抗體孵育和清洗步驟需要4-24小時(shí)，而SNAP i.d.® 2.0只需要30分鐘，且不會(huì)損失信號(hào)強(qiáng)度或降低印跡質(zhì)量。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上之后的所有免疫檢測(cè)步驟（即封閉、清洗以及一抗和二抗孵育）可在SNAP i.d.® 2.0系統(tǒng)中開(kāi)展。

必需的溶液
• 封閉液，如脫脂/低脂奶粉（0.5%或以下）、酪蛋白、牛血清白蛋白（BSA）或其他市售的封閉劑，如Bløk®-CH試劑。
• 抗體（單克隆和/或多克隆）。
• 檢測(cè)試劑。
• 清洗液：Tris或磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，添加吐溫20表面活性劑（TBST或PBST）。

必需的設(shè)備
• 真空源：泵或其他均一的真空源，可提供穩(wěn)定持續(xù)的最小壓力達(dá)到410毫巴（12英寸汞柱）的和34L/min。
• 注意：默克密理博WP61系列化工型泵可以使用，但可能需要較長(zhǎng)的處理時(shí)間。
• 一升或更大的真空瓶，帶瓶塞（用于廢液收集）。建議在真空瓶和真空源之間使用Millex®-FA50過(guò)濾器（或類似產(chǎn)品），以避免真空源被污染。
• 真空管，連接真空瓶和真空源。
• 鑷子。
• 帶有轉(zhuǎn)移蛋白的印跡。

準(zhǔn)備
1. 將SNAP i.d.® 2.0底座放在水平臺(tái)面上。
2. 將真空管連接到系統(tǒng)背面，將管子一端的接頭推入系統(tǒng)底座背面的快速斷開(kāi)裝置，直到聽(tīng)到咔嗒一聲。
3. 將管子的另一端與真空源連接。使用一升的真空瓶作為真空肼，并使用Millex®-FA50過(guò)濾器（貨號(hào)SLFA05010），以避免真空源被污染。
注意：任何可提供410毫巴（12英寸汞柱）和34L/min的真空源已足夠。如果真空源在高于410毫巴下操作，SNAP i.d.® 2.0系統(tǒng)將自動(dòng)調(diào)節(jié)真空壓力。

印跡組裝 & 常規(guī)操作
1. 按住印跡支架的支持層（藍(lán)色邊），用濕托盤(pán)中提供的蒸餾水將膜層（白色）潤(rùn)濕。將潤(rùn)濕的印跡支架放在滾動(dòng)墊上。
2. 如有必要，用甲醇和水預(yù)潤(rùn)濕印跡，然后將其放在印跡支架的中央，蛋白質(zhì)一面朝下。
3. 用印跡滾筒在印跡上輕柔滾動(dòng)以去除氣泡，然后蓋上印跡支架，再滾動(dòng)一次。
4. 打開(kāi)印跡支架框，反轉(zhuǎn)印跡支架，讓蛋白質(zhì)一面朝上，然后放回印跡支架框中。印跡支架的缺角可確保它正確放置在框內(nèi)。
5. 蓋上并鎖住印跡支架框。加入30 mL封閉液。按下印跡支架框，打開(kāi)系統(tǒng)旋鈕，施加真空。當(dāng)印跡支架框徹底清空時(shí)，關(guān)閉真空。
6. 在印跡支架的表面加入5 mL（對(duì)于Mini印跡）或10 mL（對(duì)于Midi印跡）一抗。
7. 室溫下孵育10分鐘。溶液將吸收到印跡支架內(nèi)，而表面可能看上去是干的。
8. 按下框架，施加真空。等待5-8秒后，框架徹底清空。
9. 讓真空持續(xù)，加入30 mL清洗液。重復(fù)清洗步驟3次（總共4次清洗）。當(dāng)框架徹底清空時(shí)，關(guān)閉真空。
10. 在印跡支架的表面均勻加入5 mL（對(duì)于Mini印跡）或10 mL（對(duì)于Midi印跡）二抗。室溫下孵育10分鐘，此時(shí)真空關(guān)閉。同樣，溶液將吸收到印跡支架內(nèi)，而表面可能看上去是干的。
11. 按下框架，施加真空。等待5-8秒后，框架徹底清空。讓真空持續(xù)，加入30 mL清洗液。重復(fù)清洗步驟3次（總共4次清洗）。
12. 關(guān)閉真空，從框架中取出印跡支架。從中取出印跡，與適當(dāng)?shù)臋z測(cè)試劑一起孵育。

一抗時(shí)間延長(zhǎng)
孵育：1小時(shí)至過(guò)夜
1. 開(kāi)展一般操作的第1-5步。
2. 加入5 mL（對(duì)于Mini印跡）或10 mL（對(duì)于Midi印跡）1X一抗（傳統(tǒng)免疫檢測(cè)中通常使用的濃度）。
3. 用蓋子蓋住印跡支架框。如有必要，從底座中取出，搖動(dòng)孵育。若需要過(guò)夜孵育，建議冷藏。盡管印跡支架的表面可能看起來(lái)有些干燥，但印跡不會(huì)變干，因?yàn)榭蚣軆?nèi)包含溶液。
注意：如果不止一個(gè)印跡需要延長(zhǎng)時(shí)間，印跡支架框可堆疊，以減少存儲(chǔ)空間。
4. 可選：如果要回收一抗，在第4步操作之前將抗體回收托盤(pán)放入底座。
5. 延長(zhǎng)孵育時(shí)間后，將框架放回底座，去除液體，并按照一般操作的第8-12步操作。
注意：對(duì)于SNAP i.d.® 2.0系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，延長(zhǎng)二抗的孵育時(shí)間是不必要的。建議使用5X濃度的二抗，孵育10分鐘。

抗體回收
1. 開(kāi)展一般操作的第1-5步，但將真空時(shí)間增加至2分鐘，以確保所有封閉液從框架的凹槽和通道中去除。
2. 從底座中取出印跡支架框，用紙巾擦去框架底部的所有殘留液體。
3. 將抗體收集托盤(pán)放入底座中，確保托盤(pán)的定位孔與底座的定位針對(duì)齊。
4. 將印跡支架框放回底座中。
5. 加入一抗，并按照一般操作中的第6-7步孵育。
6. 孵育10分鐘后，打開(kāi)真空，等待1分鐘，以確保所有抗體已被收集。
注意：在同時(shí)處理兩個(gè)框架時(shí)，先在一側(cè)施加真空，再在另一側(cè)。這確保每個(gè)框架都有完全的真空力，并改善回收量。
7. 關(guān)閉真空，取出框架。取出抗體回收托盤(pán)。
8. 將抗體轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)，以便保存或分析。
9. 將印跡支架框放回去，繼續(xù)一般操作的第9步。

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