癥狀

可能的原因

補救辦法

條帶彌散/扭曲

膜未在甲醇中均勻潤濕

整張膜必須用甲醇預潤濕；整張膜應均勻地從不透明變為半透明。

膜下以及堆積層的其他各層之間存在氣泡

在組裝堆積層時，利用移液管或攪拌棒，輕柔滾動以去除任何截留的氣泡。

凝膠和膜之間的接觸不均勻

確保整張凝膠和膜的表面有良好接觸。

在轉印過程中產生太多熱

運行的溫度不應超過20°C。對于槽轉印，預冷緩沖液，或在冷室中開展轉印。對于半干轉印，要么縮短運行時間，增加濾紙數量，要么降低電流。

在半干轉印過程中濾紙變干

在轉印之前確保濾紙徹底濕透，或使用更多濾紙。確保堆積層在15分鐘內組裝好。

蛋白質轉印太快；蛋白質累積在膜表面

降低電場強度。

信號弱

蛋白質穿過膜

將電壓降低最多50%，增加蛋白質必須與膜接觸的時間。

高負電荷的蛋白質（由于天冬氨酸和谷氨酸含量高）往往在電場中非常快速地移動。降低電壓，以減慢這些蛋白質的遷移。

凝膠中SDS的存在可能抑制蛋白質的結合。在轉印緩沖液中平衡凝膠至少15分鐘。

轉印緩沖液中甲醇濃度太低，不利于SDS的去除。將甲醇增加至15-20%，特別是對于較小分子量的蛋白質。

膜必須用甲醇預潤濕；整張膜應均勻地從不透明變為半透明。

蛋白質保留在凝膠中

如果轉印緩沖液中的甲醇濃度過高，它會去除蛋白質中的SDS，導致蛋白沉淀在凝膠中。這會降低高分子量蛋白質的轉移。如果蛋白沉淀是個問題，那么可在轉印緩沖液中添加SDS（0.01%-0.05%），以提高溶解度。此外，過量甲醇往往收縮或收緊凝膠，從而抑制大分子量蛋白質的轉移。

蛋白質的等電點處于或接近轉印緩沖液的pH值

等電點與轉印緩沖液的pH值相同的蛋白質將無凈電荷，因而不會在電場中遷移。為了促進轉移，嘗試更高pH值的緩沖液，如10 mM CAPS緩沖液（pH 11），包括10%甲醇，或較低pH值的緩沖液，如乙酸緩沖液。

當凝膠和/或轉印緩沖液中使用尿素時，檢測不佳

通過循環的緩沖液設置，或在冷室中運行轉印，來降低溫度。尿素受熱會引起蛋白質的氨基甲酰化，從而改變蛋白質中氨基酸的電荷。這會影響抗體識別和結合所必需的表位。

蛋白質轉移不徹底

對凝膠染色，以檢查殘留蛋白質。如果轉移不徹底，請檢查您的轉印技術。

蛋白質保留不佳

一旦轉印完成，確保膜徹底干燥，以實現蛋白質的最佳結合和固定。這應在下游檢測之前完成。

無信號

蛋白質未轉移

檢查轉移過程中凝膠和膜的方向。使用預染的分子量標準品來監控轉移。

小分子量蛋白質的轉移不佳

蛋白質保留不夠，SDS干擾小分子量蛋白質的結合

換用Immobilon^®-P^SQ轉印膜。去除轉印緩沖液中的SDS。

轉印緩沖液中的甲醇濃度低

在轉印緩沖液中使用較高比例的甲醇（15%-20%）。

蛋白質結合的時間不夠

較低電壓可優化小蛋白與膜的結合。

電流不能穿過膜。

將膜和濾紙切成與凝膠相同的大小；切勿超出。

大分子量蛋白質（~ >80 kDa）的轉印不佳

甲醇濃度過高

甲醇濃度降低至10%（v/v）或以下能讓凝膠溶脹，從而協助大分子量蛋白的轉移。而且，較低比例的甲醇也會減少蛋白的SDS損失，減少凝膠中的蛋白沉淀。對于SDS對膜結合的干擾，>200 kDa的蛋白質不如<100 kDa的蛋白質靈敏。

正電荷蛋白質的轉移不佳

蛋白質在轉移緩沖液中帶正電荷；蛋白質向陰極移動。

反轉轉印堆積層，讓Immobilon^® 轉印膜在凝膠的陰極一側。

半干轉印不佳

電流繞過凝膠堆積層

確保膜和濾紙切成與凝膠相同的大小，切勿超出。

各種大小的蛋白質轉移不佳

轉移大蛋白和小蛋白需要不同的條件

請參考“寬分子量范圍蛋白質的轉移可能需要多步的轉移”（T. Otter et al., Anal. Biochem. 162:370-377 (1987)）

在半干轉印中使用三緩沖液系統。