生物通報(bào)道：律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合，原本是細(xì)菌抵御病毒的重要武器，現(xiàn)在這一組合已經(jīng)成為了一個(gè)通用工具，被用于在真核生物中進(jìn)行位點(diǎn)特異性的基因組編輯。

由于這種基因組編輯技術(shù)更易于操作，也具有更強(qiáng)的擴(kuò)展性，CRISPRs-Cas9迅速成為了科研領(lǐng)域的新寵兒。

此前，麻省理工Broad研究所的張鋒（Feng Zhang，音譯）領(lǐng)導(dǎo)研究團(tuán)隊(duì)，構(gòu)建了一個(gè)全基因組范圍內(nèi)的CRISPR敲除文庫(kù)（GeCKO），并在黑色素瘤模型中鑒定了對(duì)維羅非尼（Vemurafenib）產(chǎn)生抵抗的突變。這項(xiàng)研究表明，除了RNAi以外，人們也可以利用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在人和小鼠細(xì)胞中進(jìn)行功能缺失性篩選。

然而，之前用于CRISPR篩選的慢病毒遞送系統(tǒng)病毒滴度較低，還需要一個(gè)已經(jīng)表達(dá)Cas9的細(xì)胞系。這無(wú)疑限制了這一技術(shù)的應(yīng)用范圍。

為此，Feng Zhang等人對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行了改進(jìn)，并在七月三十日的Nature Methods雜志上展示了升級(jí)版的CRISPR敲除文庫(kù)。Feng Zhang是麻省理工學(xué)院腦與認(rèn)知科學(xué)助理教授、McGovern 腦研究所和Broad研究所核心成員。去年七月，Feng Zhang榮獲了美國(guó)生物醫(yī)學(xué)大獎(jiǎng)：瓦利基金青年研究家獎(jiǎng)（Vallee Foundation Young Investigator Award），獎(jiǎng)金25萬(wàn)美元。其研究組研究方向?yàn)樵O(shè)計(jì)新的分子工具來(lái)操控活體大腦。

為了改進(jìn)病毒包裝和引導(dǎo)序列，研究人員構(gòu)建了一個(gè)能生成高滴度病毒的新載體（lentiCRISPRv2）。研究顯示，新載體的功能性病毒滴度比lentiCRISPRv1差不多提高了十倍。

他們?yōu)榱诉M(jìn)一步提高病毒滴度，還開(kāi)發(fā)了一個(gè)雙載體系統(tǒng)，通過(guò)不同的病毒載體分別遞送Cas9 (lentiCas9-Blast)和sgRNA (lentiGuide-Puro)。其中，lentiGuide-Puro的功能性病毒滴度比之前的lentiCRISPRv1高了將近一百倍。研究人員發(fā)現(xiàn)，升級(jí)后的單載體和雙載體系統(tǒng)都能有效介導(dǎo)基因敲除。不過(guò)雙載體系統(tǒng)可以生成表達(dá)Cas9的細(xì)胞系，而單載體lentiCRISPRv2可能更適合活體應(yīng)用或者原代細(xì)胞篩選。

此外，研究人員還設(shè)計(jì)并合成了新的人、小鼠GeCKOv2 sgRNA文庫(kù)，進(jìn)一步減少了脫靶效應(yīng)，并且新增了約一千個(gè)原始GeCKO文庫(kù)里沒(méi)有的目標(biāo)基因。（延伸閱讀：Nature子刊：黃行許教授解決基因組編輯的脫靶問(wèn)題）

這項(xiàng)研究中的小鼠、人文庫(kù)都分為兩個(gè)亞文庫(kù)，每個(gè)亞文庫(kù)有三個(gè)sgRNA與目標(biāo)基因?qū)��?yīng)，還有一千個(gè)不靶向基因的對(duì)照sgRNA。研究者們可以選擇將兩個(gè)亞文庫(kù)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行篩選，這樣每個(gè)基因就對(duì)應(yīng)六個(gè)sgRNA。在細(xì)胞數(shù)有限的情況下（例如使用原代細(xì)胞或活體篩選）也可以只采用一個(gè)亞文庫(kù)。這些升級(jí)版的慢病毒載體和文庫(kù)，進(jìn)一步拓展了CRISPR篩選的應(yīng)用范圍。

生物通編輯：葉予

生物通推薦原文：

Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening