生物通報道：基因組編輯是生物學領域的一個常用策略，可以引入新突變來進行功能研究，也可以對致病突變進行修復。現在人們手頭的編輯技術主要有三種，鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN以及CRISPR/Cas。

這三種方法都要用到特異性核酸酶，在DNA上的指定位點引入雙鏈斷裂。細胞主要通過兩種途徑來修復這樣的損傷，非同源性末端接合（NHEJ）和同源介導修復（HDR）。其種，同源重組修復能夠按照根據研究者的指令改寫DNA序列。目前，基因組編輯已經廣泛用于基因敲除、探索疾病病因、開發新藥物、以及基因治療。

從根本上來看，上述基因組編輯技術都能完成任務。不過CRISPR/Cas誕生之后，風頭很快就蓋過了ZFN和TALEN。這是因為，CRISPR/Cas系統不僅操作簡便，還有著很大的多重化潛力。

近來，CRISPR/Cas技術已經應用于各種生物（從瘧蚊到斑馬魚），催生了大量的研究成果。各大商家也沒有錯失良機，它們開發出了大量的試劑和工具，幫助研究者們開展自己的CRISPR/Cas研究。

琳瑯滿目的分子工具

ZFN和TALEN需要進行克隆、基因工程和優化，而CRISPR/Cas只需要向細胞引入Cas9核酸酶和20個核苷酸的single-guide RNA（sgRNA，引導RNA）。引導RNA負責將核酸酶帶到正確的位點進行切割。

許多公司都提供有預設計的工具來表達CRISPR/Cas元件。舉例來說，Sigma-Aldrich公司就提供了針對人、小鼠、大鼠所有基因的Cas9 和sgRNA表達質粒，用戶只需要在網上進行簡單的選購。當然，你也可以根據自己的特殊需求進行定制。

“至少從表面上看，CRISPR基因組編輯實驗設計起來要比ZFN直觀得多，因為它涉及的是RNA-DNA相互作用，”Sigma公司的Shawn Shafer說。。（延伸閱讀：Nature子刊：黃行許教授解決基因組編輯的脫靶問題）

Sigma-Aldrich公司制備有純化的sgRNA文庫，這種即用型產品可以用來直接轉染細胞，也可以與純化的Cas9核酸酶一起使用。特別適合那些想建立轉基因動物模型或擔心質粒整合的研究人員。

此外，Sigma公司還提供有配對的切口酶（nickase）設計，該產品含有表達引導RNA的兩個質粒，Cas9-D10A切口酶需要單獨訂購。這種切口酶是Cas9的突變蛋白，只切割一條DNA鏈，能夠明顯減少脫靶效應，同時保持高效的基因修飾。

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Thermo Fisher公司也有一系列支持CRISPR/Cas應用的產品。GeneArt® CRISPR核酸酶載體有兩個報告基團可選：橙色熒光蛋白（OFP）用于流式細胞分選，CD4用于磁珠富集。該產品能夠有效選擇和富集表達Cas9和CRISPR RNA的細胞。此外，Thermo Fisher公司還提供有表達Cas9的mRNA，既可以搭配RNA形式的sgRNA，也可以搭配相應的CRISPR Strings™載體（用U6啟動子在細胞中表達sgRNA的DNA載體）。

據Thermo公司的Helge Bastian介紹，CRISPR Strings™載體旨在讓新手更容易進行基因組編輯。如果以RNA的形式引入核酸酶和sgRNA，“操作者就需要進行RNA處理的培訓，還要小心避免富含RNase的環境，以免最重要的分子被降解。”使用DNA載體的話，操作起來就要簡單得多。

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rAAV和純化的Cas

Horizon Discovery公司也提供有一系列CRISPR/Cas工具，比如組成型表達Cas9核酸酶的QuickStart細胞系，只需要添加相應的sgRNA，就能夠進行基因組編輯。

該公司還開發了可用于基因組編輯的腺相關病毒載體（rAAV）。該公司的Eric Rhodes介紹說，rAAV作為單鏈DNA比傳統質粒更容易進入細胞核，可以提供更有效的基因組編輯，只不過這種載體有片段大小的限制（大約5 kb）。

NEB公司推出的CRISPR新產品是純化的Cas9核酸酶。該公司的Brett Robb指出，不通過表達載體或mRNA，直接將Cas9蛋白送進細胞，可以更精確的控制Cas9的使用劑量。目前已經有一些研究展現了這一策略的有效性。

韓國研究者構建了Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）復合體，并將其引入了體外培養的成纖維細胞和胚胎干細胞。他們發現，這一策略的位點特異性突變頻率高達79%，而且減少了與質粒轉染有關的脫靶突變。哈佛大學Alex Schier領導的研究團隊，則通過顯微注射將Cas9-sgRNA RNP引入斑馬魚胚胎。與Cas9 mRNA和sgRNA的組合相比，Cas9-sgRNA RNP的突變生成率更高。

如何評估編輯的效率和準確性

為了評估基因組編輯的效率，Thermo Fisher公司推出了GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit。該試劑盒的方案是，首先對編輯目標進行PCR擴增，隨后將PCR產物進行變性和退火。已編輯和未編輯的擴增子存在序列差異，會在退火階段形成不匹配的單鏈區域，而試劑盒里的酶可以切割這些區域。

另外，我們也可以通過基因組測序，來檢測基因組編輯之后細胞中發生的改變。今年早些時候，Ayal Hendel及其同事使用PacBio RS深度測序，評估了ZFN、TALEN和CRISPR/Cas的基因組編輯結果。

PacBio公司SMRT測序技術能帶來15 kb的讀長，正是這一特點讓PacBio特別適合于基因組編輯的評估工作，Pacific Biosciences公司的Jonas Korlach說。在基因組編輯技術中，人們廣泛使用有著長長一段同源臂的供體模板，以提高原代細胞的HDR效率。而這些供體模板對于Illumina等短讀取系統來說太長了。

研究人員指出，不論是NHEJ編輯 還是HDR 編輯，CRISPR/Cas都比TALEN更加有效。更重要的是，他們還向人們展現了一種稱為“mini-translocations”的現象。這一現象是指，編輯位點拷貝了錯誤的供體序列，比如表達核酸酶的質粒DNA，或者是其它細胞染色體DNA。研究人員甚至觀察到了，來自TALEN表達載體的289個核苷酸插入。

據介紹，Hendel等人正在著手優化HDR編輯的效率，他們希望能夠把這種技術應用到遺傳性血液病的治療中。目前HDR編輯造血干細胞的效率是3% 到5%，“我們正在想辦法提高效率，希望能盡快用這一技術進行基因治療。”

CRISPR來了，你還在等什么呢？有這么多工具在手，你需要做的只是確定一個引導RNA。Addgene、Sigma-Aldrich等機構都提供有預設計的sgRNA文庫。不過，如果你想要自己動手設計，這兩個網站應該可以幫到你：CHOPCHOP，以及張鋒博士的CRISPR Design。

參考文獻：

 [1] Kim, S, et al., “Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins,” Genome Res, 24:1012-9, 2014. [PubMed ID: 24696461]

[2] Gagnon, JA, et al., “Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs,” PLoS ONE, 9:e98186, 2014. [PubMed ID: 24873830]

[3] Hendel, A, et al., “Quantifying genome-editing outcomes at endogenous loci with SMRT sequencing,” Cell Reports, 7:293-305, 2014. [PubMed ID: 24685129]

Correction (Aug. 22): The original version of this document referred to the GeneArt portfolio as a product of Life Technologies. Life Technologies has been acquired by Thermo Fisher Scientific. The article has been updated to reflect that change.