下列操作介紹了對固定在Immobilon® PVDF轉印膜上的蛋白質進行染色的典型步驟。注意：在觀察一塊染色的印跡時，當膜還是濕的時，對比度是最好的。在照相時，使用濕的印跡和透過膜的光。

提示：在免疫檢測之前只能使用可逆染料或透照。
提示：為了觀察微弱的條帶，將甲醇濃度提高到40%。

1 通過透照法觀察

透照法是一種非破壞性的可逆技術（Reig和Klein，1988）。這種方法是基于PVDF膜浸泡在甲醇中，會從不透明變為半透明。20%的甲醇會使包被有蛋白質的膜浸濕，而無蛋白質的區域不會。

提示：在開發一種新的轉印操作或處理一種新的樣品類型時，凝膠應被染色，以驗證所有蛋白質是否從凝膠上徹底洗脫。
放置在光盒中，蛋白條帶會表現為透明的區域。與照相結合使用時，檢測靈敏度與考馬斯亮藍染料相當。

必需的設備和溶液
• 20%（v/v）甲醇
• 淺托盤，能容納膜
• 白色光盒
• 黑紙

步驟
1. 利用操作1.7 膜干燥方法（第44頁）中的一種方法，讓印跡徹底干燥。
2. 在托盤中加入足量20%的甲醇，以覆蓋印跡。
3. 將印跡放在20%甲醇中5分鐘。
4. 將印跡放在光盒中，用一張黑紙遮蓋印跡周圍的區域。
5. 條帶變成透明區域，而背景不透明（圖10，印跡A，第24頁）。
6. 如果需要永久記錄，對濕的印跡照相。
7. 當所有甲醇干燥后，印跡將恢復成它原先的樣子。

2 通過可逆染色觀察

麗春紅
這種染料產生淺色背景下的粉紅條帶。

必需的設備和溶液
• 染料：0.2%麗春紅、1%乙酸。按1:10用1%（v/v）乙酸稀釋儲液（20%染料，溶于30%（w/v）三氯乙酸和30%（w/v）磺基水楊酸）而制備。
• 甲醇，100%。
• 0.1 N NaOH。
• Milli-Q® 水。
• 淺托盤，能容納膜。

步驟
1. 如果印跡是干燥的，在100%甲醇中浸濕。
2. 在托盤中加入足量的染料，以覆蓋印跡。
3. 將印跡放入染料中，搖動1分鐘。
4. 取出印跡，用Milli-Q® 水徹底沖洗，直至達到所需的對比度。
5. 若要徹底去除染料，用0.1 N NaOH清洗印跡。

CPTS（酞菁銅四磺酸）
這種染料產生淺色背景下的翠藍色條帶。

必需的設備和溶液
• 染料：0.05%（w/v）CPTS，溶于12 mM HCl。
• 脫色液I：12 mM HCl。
• 脫色液II：20%（v/v）甲醇。
• 甲醇，100%。
• 0.1 N NaOH。
• Milli-Q® 水。
• 蛋白脫色液：0.5 M NaHCO3。
• 淺托盤，能容納膜。

步驟
1. 如果印跡是干燥的，在100%甲醇中浸濕。
2. 在托盤中加入足量的染料，以覆蓋印跡。
3. 將印跡放入染料中，搖動1分鐘。
4. 將印跡放入脫色液I中，去除多余的染料，達到所需的對比度。
5. 若要徹底去除背景中的染料，用脫色液II清洗印跡。
6. 若要使蛋白脫色，在蛋白脫色液中搖動，直至染料去除。

3 通過不可逆染色觀察

考馬斯亮藍R染料
這種染料在淺色背景下產生深色條帶。
切記：這種染料會干擾免疫檢測。

必需的設備和溶液
• 染料：0.1%（w/v）考馬斯亮藍，溶于50%（v/v）甲醇和7%（v/v）乙酸。
• 脫色液I：50%（v/v）甲醇和7%（v/v）乙酸。
• 脫色液II：90%（v/v）甲醇和10%（v/v）乙酸。
• 甲醇，100%。
• Milli-Q® 水。
• 淺托盤，能容納膜。

步驟
1. 如果印跡是干燥的，在100%甲醇中浸濕。
2. 在托盤中加入足量的染料，以覆蓋印跡。
3. 將印跡放入染料中，搖動2分鐘。
4. 取出印跡，用Milli-Q® 水短暫沖洗。
5. 將印跡放入脫色液I中，搖動10分鐘，以去除過量的染料。
6. 將印跡放入脫色液II中，搖動10分鐘，以徹底使背景脫色。

氨基黑
這種染料在淺色背景下產生深色條帶。
切記：這種染料會干擾免疫檢測。

必需的設備和溶液
• 染料：0.1%（w/v）氨基黑，溶于25%（v/v）異丙醇和10%（v/v）乙酸。
• 脫色液：25%（v/v）異丙醇和10%（v/v）乙酸。
• 甲醇，100%。
• Milli-Q® 水。
• 淺托盤，能容納膜。

步驟
1. 如果印跡是干燥的，在100%甲醇中浸濕。
2. 在托盤中加入足量的染料，以覆蓋印跡。
3. 將印跡放入染料中，搖動2分鐘。
4. 取出印跡，用Milli-Q® 水短暫沖洗。
5. 將印跡放入脫色液中，搖動5-10分鐘，以去除過量的染料。

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