生物通報道：瘧疾是由瘧原蟲屬（Plasmodium）寄生蟲感染引起，仍然是一個全球性的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。雖然許多瘧原蟲的基因組已經(jīng)測序，但是它們基因組中大約一半基因的功能，仍不明確。研究基因的功能已經(jīng)成為許多研究的重點；然而，對瘧原蟲基因組中的基因進(jìn)行編輯，仍然是低效的。

2014年7月1日，廈門大學(xué)和美國國立衛(wèi)生研究院的研究人員，在美國微生物學(xué)會旗下的學(xué)術(shù)期刊《mBio》發(fā)表的一項研究中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)的方法，來編輯瘧疾寄生蟲基因組，文章題為“Efficient Editing of Malaria Parasite Genome Using the CRISPR/Cas9 System”。

本文通訊作者是廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的袁晶教授和崔慧婷工程師。袁晶教授2002年7月畢業(yè)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院獲學(xué)士學(xué)位，2007年在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院獲理學(xué)博士學(xué)位，2007年10月至2012年10月，在美國國立衛(wèi)生研究院從事博士后研究，2012年10月至今任廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，福建省閩江學(xué)者特聘教授。2012年獲美國國立衛(wèi)生研究院院長獎（NIH Director’s Awards），2012年入選中組部第三批青年****；2014年獲863青年科學(xué)家資助。主要研究集中在兩方面：1. 以瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲為模型，研究抗藥的分子和細(xì)胞機(jī)制；2. 以鼠瘧寄生蟲為模型，研究在寄生蟲侵染宿主過程中，寄生蟲因子與宿主因子及其互作。其代表性論文曾發(fā)表在PNAS、Nature Chemical Biology、Science和mBio等國際著名期刊。

刪除或修改一個基因，是研究許多生物體基因功能的強(qiáng)大方法。各種基因編輯方法，如基因敲除（KO）、基因標(biāo)簽（gene tagging）或等位基因替換（AR）已經(jīng)被開發(fā)并廣泛用于研究瘧原蟲的基因功能。這些方法通常是基于同源重組，將包含藥物可選標(biāo)記的一段DNA插入到靶基因，或用一段修改的基因序列替換一個基因。然而，這些方法耗時且低效，需要長期的藥物選擇和寄生蟲無性繁殖。另外，DNA插入或替換的位點往往不是特異性的，發(fā)生在同源區(qū)域的隨機(jī)位點。

最近，更有效和位點特異性的基因組編輯技術(shù)，如鋅指核酸酶（ZFN）介導(dǎo)的修飾，已經(jīng)開發(fā)用于研究惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）的基因；然而，靶定位點的有限選擇和高成本，限制了這種技術(shù)的廣泛應(yīng)用。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）——另外一種開發(fā)用于許多生物體基因組編輯的有效方法，還沒有成功地應(yīng)用于瘧原蟲基因編輯。最近，另一種簡單但功能強(qiáng)大的基因組編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，已經(jīng)開發(fā)并成功地應(yīng)用于許多生物體的基因組修改，包括另外一種寄生蟲（Toxoplasma gondii）。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)起源于一種原核RNA可編程核酸酶，可以通過兩個組件（Cas9核酸酶和一個靶向sgRNA）的異源表達(dá)，在染色體上的一個特異位點引入一個雙鏈斷裂（DSB）。CRISPR/Cas9引進(jìn)的靶特異性DSBs，可以通過激活易于出錯的非同源末端連接（NHEJ）途徑，或通過同源重組（如果提供一個供體模板）得以修復(fù)。已有研究證明，在許多生物體中產(chǎn)生基因敲入（KI）、KO或AR方面，CRISPR/Cas9系統(tǒng)比其他技術(shù)更加有效，從而徹底改變了生物醫(yī)學(xué)研究的許多領(lǐng)域。

因此，需要為研究瘧疾寄生蟲的基因功能，開發(fā)一種CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因組編輯方法。然而，駐留在紅細(xì)胞（RBCs）內(nèi)的瘧原蟲，和一段外源DNA，已經(jīng)通過四層膜到達(dá)寄生蟲細(xì)胞核。與哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染相比，寄生蟲的轉(zhuǎn)染效率較低。此外，由于其寄生的生活方式，一種瘧疾寄生蟲有編碼約6500個預(yù)測基因的“減少“的基因組。

在真核細(xì)胞中的許多酶，通常不存在于寄生蟲中。例如，沒有發(fā)現(xiàn)RNA干擾（RNAi）所需的酶，因此到目前為止，不能使用RNAi來沉默瘧原蟲的基因表達(dá)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能否用來編輯瘧疾寄生蟲的基因組，仍然是一個懸而未決的問題。

在這項研究中，研究人員以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基礎(chǔ)，設(shè)計了幾種有效的方法，將位點特異性DNA雙鏈斷裂引入到約氏瘧原蟲（Plasmodium yoelii）基因組中，可通過同源重組修復(fù)。利用這個系統(tǒng)，研究人員實現(xiàn)了多個寄生蟲基因的高效基因刪除、標(biāo)記和等位基因替換。

該系統(tǒng)的開發(fā)，將大大提高我們修改瘧原蟲基因組的能力，從而影響瘧原蟲的功能研究。該研究結(jié)果明確指出，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在P. yoelii中是功能性的。將此技術(shù)應(yīng)用于其他瘧原蟲的研究中，也將非常的有吸引力。使用這種強(qiáng)大的技術(shù)，編輯瘧原蟲基因組，將大大促進(jìn)我們闡明基因功能的能力，并有望控制這種致命的疾病。

（生物通：王英）

延伸閱讀：檢測CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的副作用

生物通推薦原文摘要：
Efficient Editing of Malaria Parasite Genome Using the CRISPR/Cas9 System
ABSTRACT: Malaria parasites are unicellular organisms residing inside the red blood cells, and current methods for editing the parasite genes have been inefficient. The CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and Cas9 endonuclease-mediated genome editing) system is a new powerful technique for genome editing and has been widely employed to study gene function in various organisms. However, whether this technique can be applied to modify the genomes of malaria parasites has not been determined. In this paper, we demonstrated that Cas9 is able to introduce site-specific DNA double-strand breaks in the Plasmodium yoelii genome that can be repaired through homologous recombination. By supplying engineered homologous repair templates, we generated targeted deletion, reporter knock-in, and nucleotide replacement in multiple parasite genes, achieving up to 100% efficiency in gene deletion and 22 to 45% efficiencies in knock-in and allelic replacement. Our results establish methodologies for introducing desired modifications in the P. yoelii genome with high efficiency and accuracy, which will greatly improve our ability to study gene function of malaria parasites.