下列操作介紹了利用半干轉印系統將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）轉移到Immobilon® PVDF轉印膜的標準步驟。它適合以陽極板作為底座的半干轉印裝置。對于以陰極板作為底座的裝置，請參考使用說明書，了解建議的緩沖液和轉印堆積層。本操作介紹了一種三緩沖液的系統。單緩沖液也可使用。請咨詢制造商。

提示：對于半干轉印系統，濾紙和膜必須切成與凝膠同樣大小，這樣電流才被迫穿過凝膠。
提示：在兩種類型的轉印系統（槽和半干）中，必須格外小心，以避免在濾紙、凝膠和膜之間引入氣泡。
建議 – 在恒定電流下轉印蛋白質。如果在恒定電壓下轉印，監控電流，使其不超過0.4 amp。從100 V開始，如果電流過高，則降低電壓。
提示：Immobilon® 轉印膜的兩側同樣有效。任一側的外觀（有光澤或無光澤）對轉印和膜的檢測效率沒有影響。
提示：對于包含小肽的樣品，凝膠在轉印緩沖液中的平衡應限制在10分鐘以內。
凝膠可單獨轉移，也可多塊凝膠在單個堆積層中轉移。

必需的設備和溶液

對于單個轉移：
• 包含已分辨蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠。
• Immobilon® PVDF轉印膜，切成與凝膠相同的大小（帶有缺角）。
• 六張Whatman® 3MM濾紙或類似產品，切成與凝膠相同的大小。
• 半干轉印系統，能容納凝膠。
• 陽極緩沖液I：0.3 M Tris，pH 10.4，10%（v/v）甲醇
• 陽極緩沖液II：25 mM Tris，pH 10.4，10%（v/v）甲醇
• 陰極緩沖液：25 mM Tris和40 mM 6-氨基己酸（甘氨酸可替代），10%（v/v）甲醇，pH 9.4
• 甲醇，100%
• Milli-Q® 水

對于多個轉移，以上全部再加上：
• 透析膜，切成與凝膠相同的大小，并用Milli-Q® 水潤濕。（膜的分子量排阻應足夠小，以保留凝膠中分子量最小的蛋白質）。
• 更多濾紙。

準備

1. 準備200 mL每種陽極緩沖液和400 mL陰極緩沖液。
2. 從轉印夾中取出凝膠；切掉積層膠和點樣孔。
3. 將凝膠浸泡在200 mL陰極緩沖液中15分鐘。
4. 將兩張濾紙浸泡在陽極緩沖液I中至少30秒。
5. 將一張濾紙浸泡在陽極緩沖液II中至少30秒。
6. 將三張濾紙浸泡在陰極緩沖液中至少30秒。
7. 準備轉印膜：
a. 將膜在甲醇中浸泡15秒。膜應均勻地從不透明變成半透明。
b. 小心將膜放入Milli-Q® 水中，浸泡2分鐘。
c. 小心將膜放入陽極緩沖液II中，至少平衡5分鐘。

轉印堆積層

對于所使用的半干轉印系統，請參考制造商的具體操作說明。切記：為了確保均勻的轉移，請在堆積層中每一層的表面小心滾動移液管或攪拌棒，以去除氣泡。不要施加過大的壓力，以防止損壞膜和凝膠。

對于單個轉移：
1. 將陽極電極板放在水平臺面上。
2. 將兩張浸泡過陽極緩沖液I的濾紙放在電極板中央。
3. 將一張浸泡過陽極緩沖液II的濾紙放在前兩張上面。
4. 將膜放在濾紙上面。
5. 將凝膠放在膜上面。
6. 將三張浸泡過陰極緩沖液的濾紙放在凝膠上面。
7. 將陰極電極板放在堆積層的最上面。

對于多個轉移：
1. 將陽極電極板放在水平臺面上。
2. 將兩張浸泡過陽極緩沖液I的濾紙放在電極板中央。
3. 將一張浸泡過陽極緩沖液II的濾紙放在前兩張上面。
4. 將膜放在濾紙上面。
5. 將凝膠放在膜上面。對于最后一塊凝膠，請轉到第10步。
6. 將一張浸泡過陰極緩沖液的濾紙放在凝膠上面。
7. 將一張透析膜放在濾紙上面。
8. 將一張浸泡過陽極緩沖液II的濾紙放在透析膜上面。
9. 重復第4-8步，直到所有凝膠（直到凝膠的最大數量）都放入堆積層中。
10. 將三張浸泡過陰極緩沖液的濾紙放在膜上面。
11. 將陰極電極板放在堆積層的最上面。
切記：在運行過程中切勿碰撞陰極板蓋，因為這會擾亂轉印堆積層的對齊，使結果不準確。

蛋白質轉印

1. 將黑色陰極引線（-）插入陰極板插孔。
2. 將紅色陽極引線（+）插入陽極板插孔。
3. 將陰極引線和陽極引線連接到相應的功率輸出。
4. 打開電源開關。
5. 設定電流，按下表中顯示的時間運行：

* 表面積（cm2）是根據陽極板上堆積層的尺寸計算的。此數值與堆積層中的凝膠數量無關。
6. 在轉印完成后，關閉電源。
7. 斷開系統的引線。
8. 取下蓋子。
9. 取出并丟棄濾紙。
注意：在使用石墨板時，陽極電極板上的石墨顆粒偶爾會出現在濾紙上。這些顆粒不會影響操作。
10. 取出凝膠。
11. 用鑷子取出轉印膜。

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