質(zhì)譜分析

利用Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行質(zhì)譜分析

質(zhì)譜（MS）是一種用于鑒定印跡上蛋白質(zhì)的分析方法。用MS兼容的染料（考馬斯亮藍(lán)、氨基黑或Sypro®染料）對(duì)PVDF膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色后，目的條帶被剪下來(lái)，并進(jìn)行胰蛋白酶消化。所產(chǎn)生的肽片段可用質(zhì)譜法分析（Gharahdaghi等，1996；Bienvenut等，1999；Bunai等，2003）。圖17顯示了一張MALDI-TOF圖譜，其中膜上消化的牛蛋白被成功鑒定為過(guò)氧化氫酶。

另一個(gè)要考慮的方法是直接在轉(zhuǎn)印的Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。這種方法通常適用于2-D凝膠分離的蛋白質(zhì)。通過(guò)平行處理，凝膠上的所有蛋白質(zhì)同時(shí)被水解消化，并電轉(zhuǎn)到Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜上，隨后經(jīng)過(guò)掃描，以查看肽段是否存在（Binz等，1999；Bienvenut等，1999；Bienvenut等，2003）。或者，采用另一種被稱(chēng)為“化學(xué)印刷”的方法（Wallace等，2001；Gooley等，1998），首先將雙向分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并觀察，然后直接在斑點(diǎn)上分配極少量的胰蛋白酶進(jìn)行消化（Sloane等，2002）。在這兩種方法中，膜都會(huì)被噴上基質(zhì)，并通過(guò)MALDI-TOF MS直接掃描。通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖譜分析來(lái)鑒定蛋白質(zhì)。圖18顯示了2-D分離后的人血漿蛋白轉(zhuǎn)移到Immobilon®-PSQ轉(zhuǎn)印膜上，并獲得兩個(gè)MALDI-TOF圖譜，以鑒定膜固定化的蛋白質(zhì)。

圖17. 肝臟蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色印跡中一條帶的MALDI-TOF圖譜，利用操作5.1。膜上蛋白質(zhì)消化，第57頁(yè)（Bienvenut等，1999）。此蛋白質(zhì)被鑒定為牛過(guò)氧化氫酶，有著6.4e+06的MOWSE分?jǐn)?shù)和34% 覆蓋度。數(shù)據(jù)在Bruker® Autoflex™質(zhì)譜儀上獲得。搜索是利用Protein Prospector進(jìn)行的。

圖18. 人血漿通過(guò)雙向電泳分離，并轉(zhuǎn)移到（左）Immobilon®-PSQ轉(zhuǎn)印膜和（右）MALDI-TOF，直接收集自胰蛋白酶消化蛋白的膜表面。人血漿通過(guò)雙向電泳分離，電轉(zhuǎn)到Immobilon®-PSQ轉(zhuǎn)印膜上，并粘附到MALDI靶板上。胞內(nèi)胰蛋白酶的消化在膜表面直接開(kāi)展。消化需要納升級(jí)的酶，并利用ChIP™通過(guò)按需壓電噴墨裝置微噴在膜表面上（Proteome Systems和島津公司）。由此產(chǎn)生的肽段通過(guò)AXIMA™-CFR（島津公司）來(lái)分析。MALDI-TOF MS并利用肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定。肽段直接在膜表面分析，其中MALDI基質(zhì)在消化前被微噴在消化蛋白的上面。數(shù)據(jù)由J.L. Duff、F.G. Hopwood、C.J. Hill、A.A. Gooley博士友情提供（Proteome Systems，澳大利亞悉尼）。

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