質譜分析

利用Immobilon® PVDF轉印膜進行質譜分析

質譜（MS）是一種用于鑒定印跡上蛋白質的分析方法。用MS兼容的染料（考馬斯亮藍、氨基黑或Sypro®染料）對PVDF膜上的蛋白質進行染色后，目的條帶被剪下來，并進行胰蛋白酶消化。所產生的肽片段可用質譜法分析（Gharahdaghi等，1996；Bienvenut等，1999；Bunai等，2003）。圖17顯示了一張MALDI-TOF圖譜，其中膜上消化的牛蛋白被成功鑒定為過氧化氫酶。

另一個要考慮的方法是直接在轉印的Immobilon® PVDF轉印膜上進行蛋白質譜分析。這種方法通常適用于2-D凝膠分離的蛋白質。通過平行處理，凝膠上的所有蛋白質同時被水解消化，并電轉到Immobilon® PVDF轉印膜上，隨后經過掃描，以查看肽段是否存在（Binz等，1999；Bienvenut等，1999；Bienvenut等，2003）。或者，采用另一種被稱為“化學印刷”的方法（Wallace等，2001；Gooley等，1998），首先將雙向分離的蛋白轉移至PVDF膜上并觀察，然后直接在斑點上分配極少量的胰蛋白酶進行消化（Sloane等，2002）。在這兩種方法中，膜都會被噴上基質，并通過MALDI-TOF MS直接掃描。通過肽質量指紋圖譜分析來鑒定蛋白質。圖18顯示了2-D分離后的人血漿蛋白轉移到Immobilon®-PSQ轉印膜上，并獲得兩個MALDI-TOF圖譜，以鑒定膜固定化的蛋白質。

圖17. 肝臟蛋白的考馬斯亮藍染色印跡中一條帶的MALDI-TOF圖譜，利用操作5.1。膜上蛋白質消化，第57頁（Bienvenut等，1999）。此蛋白質被鑒定為牛過氧化氫酶，有著6.4e+06的MOWSE分數和34% 覆蓋度。數據在Bruker® Autoflex™質譜儀上獲得。搜索是利用Protein Prospector進行的。

圖18. 人血漿通過雙向電泳分離，并轉移到（左）Immobilon®-PSQ轉印膜和（右）MALDI-TOF，直接收集自胰蛋白酶消化蛋白的膜表面。人血漿通過雙向電泳分離，電轉到Immobilon®-PSQ轉印膜上，并粘附到MALDI靶板上。胞內胰蛋白酶的消化在膜表面直接開展。消化需要納升級的酶，并利用ChIP™通過按需壓電噴墨裝置微噴在膜表面上（Proteome Systems和島津公司）。由此產生的肽段通過AXIMA™-CFR（島津公司）來分析。MALDI-TOF MS并利用肽質量指紋圖譜鑒定。肽段直接在膜表面分析，其中MALDI基質在消化前被微噴在消化蛋白的上面。數據由J.L. Duff、F.G. Hopwood、C.J. Hill、A.A. Gooley博士友情提供（Proteome Systems，澳大利亞悉尼）。

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