了解下列章節中提出的有關免疫檢測的概念，將有助于優化特定樣品的操作。

• 緩沖液

最常用的兩種緩沖液是磷酸鹽緩沖液（PBS）和Tris緩沖液（TBS）。調整配方中緩沖液組分的各種改良配方已見諸期刊。緩沖液的關鍵要求是它應有助于保持抗體的生物活性。因此，離子強度和pH值應相當接近生理狀態。PBS的配方（磷酸鹽總濃度10 mM）適用于廣泛的抗體和檢測底物。

在孵育過程中，裝有膜的容器應輕輕搖動。緩沖液的量應足夠，完全覆蓋膜，使其在緩沖液中自由漂浮。如果不止一張印跡放在容器中，緩沖液容量不足會導致印跡膜粘在一起。這將影響孵育溶液的充分接觸，導致各種假象，如背景高、信號弱和靈敏度不均勻等。

• 封閉

要獲得有意義的結果，必須保證抗體只與感興趣的蛋白質結合，而不與膜結合。利用惰性蛋白、非離子去污劑，或無蛋白的封閉劑（如Bløk® noise-canceling試劑）來封閉膜上未被占據的位點，可減少抗體的非特異結合（NSB）。封閉劑與膜的親和力應高于抗體。它應填滿膜上未被占據的位點，但不會替換膜上的目標蛋白。最常用的封閉劑是牛血清白蛋白（BSA，0.2-5.0%）、脫脂牛奶、酪蛋白、明膠、吐溫20去污劑的稀釋液（0.05-0.1%）以及Bløk®試劑。研究表明，吐溫20去污劑對抗原有復性的作用，從而能夠提高特異抗體對抗原的識別（Van Dam等，1990；Zampieri等，2000）。其他去污劑，如Triton® X-100去污劑、SDS和NP-40，有時也會使用，但可能會太過劇烈而破壞了蛋白之間的相互作用。封閉劑通常溶解在PBS或TBS中。

與封閉相關的風險包括：選擇不適當的封閉劑或過量封閉會替換或掩蓋目標蛋白質。因此，封閉劑的正確選擇對成功的免疫檢測很關鍵。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白標記的抗體，因為牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特異性抗體對磷酸化蛋白進行檢測分析時，如果采用粗蛋白制劑作為封閉劑，由于這些制劑中可能含有磷酸酶，而印跡上的磷酸化蛋白會被這些酶去磷酸化，就有可能會影響分析結果。研究表明，在封閉液中添加磷酸酶抑制劑可增強磷酸化特異性抗體的信號（Sharma和Carew，2002）。此外，適用于一種抗原-抗體組合的封閉劑可能不適用于其他組合。

封閉劑和檢測試劑之間的兼容性可通過操作1.5（第41頁）中介紹的斑點印跡方法來確定。封閉液被點樣在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸潤，并在TBS中平衡。隨后在印跡上添加檢測試劑，孵育5分鐘，并曝光在X射線膠片上。暗斑的出現則表明封閉劑與檢測試劑不兼容（圖19，第42頁）。必須記住，與Immobilon®-P轉印膜相比，Immobilon®-PSQ轉印膜的表面積更高，孔徑更小，可結合更多的蛋白質。如果在標準的Western印跡操作中用Immobilon®-P轉印膜來替代Immobilon®-PSQ轉印膜，那么封閉液可能不足以飽和膜表面。可能需要更多的清洗步驟來降低背景。利用斑點印跡方法，可方便地優化封閉（第40頁）。

• 抗體

在封閉之后，印跡與一個或多個抗體孵育。第一個抗體與目標蛋白結合，而第二個抗體與第一個結合。第二個抗體結合有酶或染料，可用來指示蛋白的位置。

盡管一抗能直接標記，但使用二抗有明顯的優勢。首先，不止一個二抗分子能夠與單個一抗分子結合，形成信號擴增。其次，標記的二抗（酶-抗體結合物）可用于大量不同特異性的一抗，從而不再需要標記多個一抗。

多克隆或單克隆的一抗都可使用。多克隆抗體通常是以抗血清或親和純化的抗體形式提供的。單克隆抗體是在腹水或組織培養液中表達的，可直接使用或進行親和純化。一定要記住，變性蛋白可能無法被天然抗原培育出的抗體所識別。在某些情況下，可能需要非變性凝膠來進行印跡。抗體以緩沖液和封閉液稀釋，以避免與膜的非特異結合。抗體稀釋液通常也包含痕量的吐溫20或另一種去污劑，以防止抗體的非特異聚集。許多發表的化學發光操作需要在封閉液和抗體稀釋液中添加0.1%（v/v）吐溫20。我們必須認識到，高于0.05%（v/v）的濃度有可能從膜上洗掉一些印跡的蛋白質。

提高吐溫20去污劑的濃度通常會降低背景。一種更簡單且更經濟的策略是降低抗體的濃度，特別是二抗（詳見圖12）。抗體必須特異針對目的蛋白，不能與封閉液中的組分交叉反應，且應該是相對純凈的。其他蛋白質或聚集物形式的雜質會導致非特異性結合和背景增高。

免疫檢測是一種極其靈敏的方法。為了實現高的信噪比和最高的靈敏度，一抗和二抗的濃度應針對每種情況來優化。一般來說，高倍稀釋一抗或降低凝膠上的蛋白上樣量可減少非特異信號。高倍稀釋酶標記的二抗可最大限度降低整體的高背景。

一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測試劑的靈敏度。高靈敏度的試劑（檢測到飛克級）與低靈敏度的試劑（檢測到皮克級）相比，抗體用量可減少20倍。抗體濃度的優化取決于檢測底物的例子如圖13所示。在使用最靈敏的檢測試劑（Luminata™ Forte試劑）時，過量的抗體導致高的非特異性和整體背景增高（左上）。在這種情況下，將一抗稀釋度從1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用沒那么靈敏的檢測試劑（中間和最下面一行）時，抗體需要更為濃縮，以產生相同的信號。

圖12. 二抗稀釋度的優化，利用Immobilon® Western化學發光HRP底物對ERK1進行免疫檢測。大鼠肝臟裂解液的兩倍稀釋物被上樣到每塊凝膠上。電轉后的蛋白質與兔抗ERK1抗體（1:1,000稀釋）以及HRP結合的山羊抗兔IgG（1:5,000、1:20,000和1:100,000稀釋，從左到右）雜交。

圖13. 檢測試劑越靈敏，需要的抗體越少。包含指定量A431裂解液的免疫印跡與不同濃度的GAPDH抗體（貨號 MAB374）雜交，如最上面一行，再與適當的二抗雜交。利用指定的Luminata™ HRP底物觀察條帶，并在X射線膠片上曝光5分鐘。在這三種檢測試劑中，Luminata™ Forte試劑最靈敏，Luminata™ Cresendo次之，最后是Luminata™ Classico試劑。

使用靈敏度較高的HRP底物，有三方面的優點：

1. 結果更佳：它產生更強的條帶，帶來更為定量的印跡（比較Luminata™ Cresendo和Forte底物在1:10,000稀釋度下條帶強度的增加）
2. 更快速：清洗印跡和添加新底物只需要10分鐘，而重復抗體孵育需要2.5小時。
3. 更便宜：HRP底物比抗體要便宜得多。

• 清洗

清洗印跡，從膜上去除未結合的抗體，它們可能導致高背景和檢測不佳。通常使用吐溫20的PBS或TBS稀釋液（0.05% v/v），特別是當抗體制劑是粗制的，或高濃度使用時。如前所述，濃縮的去污劑溶液可能導致感興趣的蛋白質從膜上洗脫。對于高度純化的抗體，往往只使用緩沖液進行清洗。

所需的清洗次數最好根據實驗來確定。清洗太少會產生過多的背景，而清洗過度有可能洗脫抗體并降低信號。建議至少清洗三次，每次5分鐘。

在TBS清洗液中添加最多0.5 M NaCl和0.2% SDS，并將清洗時間延長至2小時，可降低頑固的背景。