生物通報道：DNA編輯技術CRISPR近年來風生水起，已經開始取代了其它基因組編輯工具，如鋅指核酸酶和 TALENs等。不過目前科學家們對于這一技術中的RNA引導核酸內切酶：Cas9了解的還不夠多，如果能更精確的掌握這種酶在CRISPR系統中如何發揮作用的，將能提高這一技術的使用效率和特異性。

5月16日Science雜志發表了題為“Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution”的綜述性文章，指出近期的一些生化試驗和結構研究有助于解析Cas9這種關鍵酶，這些研究成果為未來合成生物學，轉化醫學研究，以及新一代基因組工程中的新應用奠定了基礎。

CRISPR本身是一種防御系統，用以保護細菌和古細菌細胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的CRISPR位點能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子RNA 。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA就能通過互補序列結合病毒基因組，并表達CRISPR相關酶，也就是Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA ，阻止病毒完成其功能。

將CRISPR/ Cas系統用于其它非細菌細胞需要滿足兩個條件：一個Cas酶，用于切斷靶標DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個就是稱為導向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過互補結合靶標。

其中Cas酶至關重要，為了能更好的利用這一技術工具，不少實驗室解析了這種酶的精確分子機制，探索其如何靶向和作用于DNA的。近期Sternberg等人就確定了Cas9在病毒感染過程中是如何在RNA序列的引導下識別和降解外源DNA，以及在動物和植物細胞中誘導位點特異性遺傳改變的。

研究人員通過結合單分子成像和大量的生化試驗，證實Cas9的基因組編輯能力是通過稱作為“PAM”（ protospacer adjacent motif）的短DNA序列來實現的。這一研究揭示了PAM的兩個主要功能，解釋了它對于Cas9能夠靶向和切割與導向RNA相匹配的DNA序列如此至關重要的原因。在外源DNA的靶向位點附近存在PAM，而宿主基因組的這些靶向位點則缺乏PAM，使得Cas9能夠精確區分必須降解的非自身DNA和幾乎完全相同的自身DNA。此外，存在PAM也是激活Cas9酶的必要條件。

研究人員指出，Cas9只在識別PAM后才利用RNA–DNA堿基配對來解讀DNA尋找匹配的序列，這樣避免了意外地靶向細菌自身基因組中的匹配位點。然而，即使Cas9以某種方式與自身基因組中的一段匹配序列錯誤地結合，沒有PAM也無法觸發催化核酸酶的活性。利用這種DNA解讀機制，PAM提供了兩個冗余的檢查點，確保Cas9不會錯誤地破壞它自身的基因組DNA。

此外，在結構研究方面，瑞士蘇黎世大學、美國加州大學伯克利分校等處的研究人員今年2月首次解析出酶Cas9的詳細三維結構圖：研究人員利用X射線晶體分析法獲得兩種主要類型的Cas9酶的2.6埃和2.2埃分辨率的晶體結構圖。然后利用單顆粒電子顯微術(single-particle electron microscopy)揭示出Cas9與它的導向RNA(guide RNA, gRNA)如何合作從而與靶DNA序列相互作用。

結構分析顯示Cas9具有相同的結構核心，這個結構核心的特征為一種具有兩個主葉(major lobe)——一個核酸酶結構域葉和一個α-螺旋葉---的蛤蜊形狀(clam-shaped)的結構。這兩個主葉含有保守性的裂縫，而這些裂縫在核酸結合中發揮功能。

還有來自麻省理工等處的研究人員首次報道的Cas9復合體的高分辨率圖片，從中揭示出這種Cas9復合體的勞動分工。

研究人員發現Cas9由兩個裂片(lobe)組成：一個裂片參與識別向導RNA和靶DNA組分，另一個裂片負責切割靶DNA，導致雙鏈DNA斷裂從而讓靶基因失去功能。而且他們也發現Cas9與導向RNA之間的界面上的關鍵性結構，當Cas9準備切割靶DNA鏈時，這些結構允許Cas9在導向RNA和靶DNA周圍自我組裝。

這些生化機理和結構上的重要成果將有助于解決CRISPR系統應用中的一些問題，從而更好的改進CRISPR技術，滿足科學家們的要求。（生物通：張迪）

原文摘要：

Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution

The ability to add, remove, or change DNA sequences is essential to studies that investigate the genetic under-pinning of phenotypic traits. With its unprecedented effi ciency and stunning ease of use, DNA editing technology based on the prokaryotic CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats)Cas9 system is completely revolutionizing genome engineering. In little more than a year, CRISPR-Cas9 editing has been implemented in a multitude……